Science ： 高通量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)深入解讀大腦內(nèi)GPCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

今天跟大家分享一篇最新發(fā)表在science上的文章‘In vivo brain GPCR signaling elucidated by phosphoproteomics’，通訊作者是來自德國馬克斯普朗克生物化學(xué)研究所的Matthias Mann教授。Matthias Mann教授是蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的領(lǐng)軍人物，其課題組一直致力于質(zhì)譜技術(shù)的開發(fā)和在生物學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用，例如我們熟知的組學(xué)定量方法SILAC以及MaxQuant系列算法等都是由其建立，并且通過與生物學(xué)家的廣泛合作，該課題組利用先進(jìn)的質(zhì)譜技術(shù)先后在人類蛋白質(zhì)組水平揭示了大量存在的磷酸化位點(diǎn)譜圖、賴氨酸乙�；�位點(diǎn)譜圖以及糖基化位點(diǎn)譜圖等。

該篇science的工作也是該課題組發(fā)展的一種“高通量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)（EasyPhos）”技術(shù)的拓展應(yīng)用。EasyPhos技術(shù)是Mann實(shí)驗(yàn)室于2015年開發(fā)的用于快速高通量定量磷酸化位點(diǎn)并實(shí)現(xiàn)深度覆蓋的技術(shù)，例如可同時(shí)在96孔板中對不同種類的細(xì)胞或組織的磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析并鑒定到>10000個(gè)磷酸化位點(diǎn)。

傳統(tǒng)的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程包括使用FASP（過濾輔助樣品制備）或基于尿素的蛋白質(zhì)酶解、肽段脫鹽和懸干、肽分餾（fractionation）、IMAC或TiO 2富集磷酸肽以及LC-MS/MS技術(shù)鑒定，而EasyPhos技術(shù)優(yōu)化了蛋白質(zhì)酶解buffer，使其與磷酸肽段的富集兼容，從而省去了肽段脫鹽和肽分餾的步驟，同時(shí)使該樣品制備能在96孔板中進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)了高通量操作。

而該篇science工作利用EasyPhos技術(shù)，以阿片受體（一種G蛋白偶聯(lián)受體）為模型，通過對小鼠大腦不同區(qū)域內(nèi)50000個(gè)磷酸化位點(diǎn)的量化，深度解讀了大腦內(nèi)阿片受體被激動(dòng)劑激活之后的信號通路變化。

G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）超家族是神經(jīng)疾病的主要藥物靶標(biāo)，但即使刺激單一的GPCR通常也會(huì)激活許多平行的信號通路，每個(gè)通路都會(huì)導(dǎo)致獨(dú)特的藥理結(jié)果，因此基于GPCR設(shè)計(jì)的激動(dòng)劑藥物都會(huì)或多或少的有些副作用。以kappa阿片受體（kappa opioid receptor，KOR）為例，KOR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，且在不同的大腦區(qū)域表達(dá)量不同，激活后的生理效果也不一樣。

現(xiàn)有的研究已經(jīng)表明KOR激動(dòng)劑藥物激活KOR后，會(huì)引起膜電位超級化，使神經(jīng)遞質(zhì)釋放減少，阻斷神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞，因而該類藥物具有很好的鎮(zhèn)痛、抗驚厥等療效。但不幸的是，該類藥物會(huì)誘發(fā)焦慮、厭惡等副作用，對于副作用的機(jī)制至今沒有很好的解釋以及相應(yīng)的治療策略。該研究中，作者利用高通量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)對KOR激動(dòng)劑誘導(dǎo)的信號通路進(jìn)行了深度解析并找到了其誘導(dǎo)厭惡副作用的靶點(diǎn)。

首先作者用五種不同結(jié)構(gòu)的KOR激動(dòng)劑注射小鼠，于注射后5分鐘和30分鐘后，分別獲取了大腦五個(gè)區(qū)域的組織（紋狀體、海馬、皮質(zhì)、延髓和小腦，前四種組織不同程度表達(dá)KOR，最后一種組織不表達(dá)KOR），接著利用EasyPhos技術(shù)對五種組織的磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行了鑒定，實(shí)現(xiàn)了對6700個(gè)腦蛋白的50000個(gè)磷酸化位點(diǎn)的定量，并觀察到不同的KOR激動(dòng)劑對這些磷酸化位點(diǎn)的擾動(dòng)程度是不一樣的，且具有區(qū)域特異性和時(shí)間動(dòng)態(tài)性。

其中激動(dòng)劑 U-50,488H對這些磷酸化位點(diǎn)擾動(dòng)最大，且主要集中在紋狀體區(qū)域，例如注射U-50,488H激動(dòng)劑5分鐘后，紋狀體即有1000個(gè)磷酸化位點(diǎn)發(fā)生變化，對這些磷酸化位點(diǎn)發(fā)生變化的蛋白進(jìn)行GO生物功能分析發(fā)現(xiàn)主要在 “神經(jīng)遞質(zhì)分泌” 和 “多巴胺能神經(jīng)突觸” 功能中有富集。鑒于副作用厭惡狀態(tài)的出現(xiàn)是由于紋狀體區(qū)域伏核（nucleus accumbens，NAc）內(nèi)的棘突神經(jīng)元被激活，因此作者接下來著重關(guān)注給予KOR激動(dòng)劑處理后紋狀體區(qū)域內(nèi)突觸蛋白磷酸化水平差異。作者通過對U-50,488H刺激5分鐘后紋狀體突觸蛋白磷酸化水平的差異分析發(fā)現(xiàn)，突觸蛋白被大規(guī)模去磷酸化，于是作者猜測U-50,488H可能特異性激活了Ser/Thr 磷酸酶系統(tǒng)。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者給小鼠注射了磷酸酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)U-50,488H誘導(dǎo)的突觸蛋白的廣泛去磷酸化現(xiàn)象消失，證明了磷酸酶在突觸GPCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要性。更重要的是，作者通過對U-50,488H誘導(dǎo)的信號通路的變化分析發(fā)現(xiàn)，mTOR信號通路是排在首位的，被U-50,488H顯著激活，而以往的研究也表明紋狀體內(nèi)mTOR信號通路功能障礙跟重度抑郁有關(guān)系。于是作者進(jìn)一步猜測KOR激動(dòng)劑U-50,488H誘導(dǎo)的厭惡副作用跟mTOR通路有關(guān)。

為了驗(yàn)證這一猜測，作者先給予小鼠mTOR信號通路抑制劑處理1h后再給予U-50,488H處理，小鼠動(dòng)物模型的厭惡副作用消失，而其鎮(zhèn)痛、抗驚厥的療效不受影響。

該研究首次利用高通量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)深入解讀大腦內(nèi)GPCR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為治療GPCR激動(dòng)劑藥物誘發(fā)的副作用以及未來開發(fā)更有效的GPCR藥物提供研究策略。

文章引用：DOI: 10.1126/science.aao4927

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http://science.sciencemag.org/content/360/6395/eaao4927.full