活體顱骨光透明技術(shù)在光學(xué)成像中的應(yīng)用

       活體腦成像對(duì)于研究大腦生理病理活動(dòng)有著至關(guān)重要的意義�，F(xiàn)代光學(xué)成像技術(shù)侵入性低、分辨率高，因而能夠用于活體觀測(cè)生物結(jié)構(gòu)和功能，在腦科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。但是，在活體狀態(tài)下，大腦表面的顱骨對(duì)光的強(qiáng)散射嚴(yán)重限制了光的穿透深度，進(jìn)而影響了皮層成像的深度和質(zhì)量。為了克服顱骨的散射，以往的研究往往需要在成像前建立各類手術(shù)顱窗，主要包括開(kāi)顱玻璃窗、磨薄顱骨窗以及它們的變體。開(kāi)顱玻璃窗雖然可用于動(dòng)物腦部成像，但是，開(kāi)顱手術(shù)容易導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而開(kāi)顱后3天逐漸形成白色絮狀物影響后續(xù)成像效果，且往往會(huì)持續(xù)約 2周，因此并不適合急性模型（3天以內(nèi)）的觀測(cè)及長(zhǎng)期（2周以上）活體成像監(jiān)測(cè)。磨薄顱骨窗的建立通過(guò)將部分顱骨磨薄至約 25 μm左右，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)皮層的活體高分辨觀測(cè)。但磨薄顱骨窗不適用于大視場(chǎng)觀測(cè)皮層，因?yàn)閷⒋竺娣e的顱骨均勻地磨薄至25 μm的難度非常大。另外，顱骨被磨薄后會(huì)重新生長(zhǎng)，并且新生的顱骨易碎，難以實(shí)現(xiàn)多次的重復(fù)打磨。所以，磨薄顱骨窗不適用于長(zhǎng)期反復(fù)跟蹤觀測(cè)。

       近些年興起的組織光透明技術(shù)可以降低生物組織的散射，增強(qiáng)光在組織中的穿透能力，已被廣泛應(yīng)用于離體大組織甚至全器官三維高分辨成像。不僅如此，組織光透明技術(shù)在活體水平也得到了很好的應(yīng)用。研究人員發(fā)展的活體顱骨光透明技術(shù)，以及基于此建立的光透明顱窗，可以在不進(jìn)行開(kāi)顱手術(shù)的情況下，結(jié)合多種現(xiàn)代光學(xué)成像手段，實(shí)現(xiàn)大腦皮層的神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)和功能的無(wú)創(chuàng)成像觀測(cè)。針對(duì)不同的應(yīng)用場(chǎng)景，開(kāi)發(fā)了不同的光透明顱窗，可以分別滿足高分辨、大視場(chǎng)、長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè)等要求。相比于開(kāi)顱玻璃窗，光透明顱窗可以避免手術(shù)帶來(lái)的炎癥反應(yīng)等副作用，從而適用于急性觀測(cè)；而相比于磨薄顱骨窗，光透明顱窗可以通過(guò)反復(fù)建立而觀測(cè)數(shù)月，從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期跟蹤監(jiān)測(cè)。

       目前的活體顱骨光透明方法包括以下幾種：（1）用于提升皮層血管成像質(zhì)量的顱骨光透明方法（SOCS）[1]；（2）用于實(shí)現(xiàn)神經(jīng)樹突棘分辨的顱骨光透明方法（SOCW）[2]；（3）大視場(chǎng)、可重復(fù)性顱骨光透明方法（USOCA）[3]；（4）可見(jiàn)-近紅外兼容的光透明方法（VNSOCA）[4]；（5）用于長(zhǎng)期觀測(cè)的顱骨光透明方法（TIS）[5]。本文主要介紹活體顱骨光透明技術(shù)在光學(xué)成像中的應(yīng)用。

（1）激光散斑襯比/高光譜成像

       血流和血氧變化是反應(yīng)血管功能的重要指標(biāo)，監(jiān)測(cè)皮層血流、血氧信息對(duì)于研究多種腦疾病有著重要的意義。激光散斑襯比成像是一種非標(biāo)記的、高時(shí)空分辨的血流分布成像技術(shù)；高光譜成像技術(shù)是一種非標(biāo)記的血氧分布成像技術(shù)。顱骨光透明技術(shù)的出現(xiàn)使其得以在完整顱骨下獲取皮層血流及血氧信息。

圖1. 重復(fù)光透明成像用于皮層血流和血氧監(jiān)測(cè)[3]。（a）顱骨短期重復(fù)透明成像；

（b）顱骨長(zhǎng)期重復(fù)透明成像。

       利用顱骨光透明技術(shù)，可以持續(xù)一周地每天對(duì)小鼠進(jìn)行顱骨透明化操作并獲取血流血氧信息（圖1. a）。不僅如此，研究人員對(duì) 2 月齡的小鼠進(jìn)行了每月一次、為期 5個(gè)月的持續(xù)成像，并成功觀察到皮層血管網(wǎng)的動(dòng)態(tài)變化，即部分血管的消失和新生（圖1. b）。除了對(duì)單側(cè)顱骨進(jìn)行透明外，研究人員還對(duì)小鼠雙側(cè)顱骨進(jìn)行光透明處理，用于監(jiān)測(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）后雙側(cè)皮層血流及血氧變化（圖2）。

圖2. 光透明顱窗用于監(jiān)測(cè)MCAO引起的皮層血流動(dòng)力學(xué)變化[3]。（a）MCAO前后雙側(cè)皮層血流及血氧變化；（b-c）皮層血流及血氧變化柱狀圖。

（2）光聲成像

      光聲成像是近十年來(lái)出現(xiàn)的一種基于激光超聲的生物醫(yī)學(xué)成像新方法。它是一種混合成像方式，結(jié)合了光學(xué)成像的高對(duì)比度和基于光譜的特異性以及超聲成像的高穿透深度，克服了傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)成像手段的不足。然而，由于顱骨的存在，光聲成像在大腦中的應(yīng)用受到了阻礙。顱骨光透明技術(shù)可以通過(guò)降低光學(xué)散射特性來(lái)改善光進(jìn)入深層組織的傳輸。研究人員發(fā)現(xiàn)，顱骨光透明技術(shù)可以抑制渾濁顱骨所引入的激光和刺激超聲的衰減和失真，增加光聲成像的光學(xué)分辨率（OR）和聲學(xué)分辨率（AR），而且光聲顯微鏡用于大腦微血管成像的性能提高（圖3）。該技術(shù)為解決光聲成像中顱骨受限問(wèn)題提供了一種簡(jiǎn)便易行的方法，對(duì)神經(jīng)血管學(xué)研究具有重要意義。

圖3. 光透明顱窗結(jié)合光聲成像觀察皮層血管結(jié)構(gòu)[6]。(a) 未處理顱骨的反射圖像；(b) 顱骨光透明后顱骨的反射圖像；(c) 完整顱骨的光聲成像；(d) 顱骨光透明后的光聲成像；

(e) 圖(c)和(d)中綠色箭頭所示同一血管的光聲信號(hào)；(f) 顱骨光透明處理前后光聲信號(hào)

振幅和血管直徑的統(tǒng)計(jì)分析。

（3）受激拉曼成像

      受激拉曼散射成像是一種新型的相干拉曼散射成像技術(shù)，利用基于分子振動(dòng)特征的化學(xué)特異性，可以實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記生物成像，展現(xiàn)出了無(wú)標(biāo)記、快速、高靈敏度、高特異性等優(yōu)勢(shì)。研究人員通過(guò)受激拉曼成像分析了顱骨光透明過(guò)程中顱骨的主要成分---膠原蛋白和羥基磷灰石（鈣質(zhì)）的變化，對(duì)顱骨光透明技術(shù)的作用機(jī)制進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)活體顱骨光透明的基本原理是（部分）去除顱骨中的鈣質(zhì)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，并使用折射率匹配試劑進(jìn)一步提高透明效果（圖4）。該研究為未來(lái)活體光透明方法的發(fā)展提供了理論依據(jù)，可以用于篩選更高效的活體顱骨及其他組織光透明方法。

圖4. 受激拉曼成像揭示顱骨光透明技術(shù)的機(jī)制[7]。（a-c）幼年小鼠頂骨中膠原纖維和羥基磷灰石顯微結(jié)構(gòu)圖像。顱骨未處理（a），10 %膠原酶處理（b），10 % EDTA處理（c）。

（d-f）成年小鼠頂骨中膠原纖維和羥基磷灰石的微觀結(jié)構(gòu)變化。顱骨未處理（d）， USOCA處理（e），10 % EDTA處理（f）。

（4）雙光子/三光子成像

       與其它光學(xué)活體成像相比，雙光子/三光子成像具有較高的空間分辨率，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與亞細(xì)胞分辨水平的結(jié)構(gòu)成像研究，已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域一項(xiàng)有力的研究工具。一般來(lái)說(shuō)，雙光子/三光子應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究時(shí)需要配合開(kāi)顱玻璃窗或者磨薄顱骨窗，而活體顱骨光透明技術(shù)的發(fā)展為其應(yīng)用提供了一種新型的非侵入式的觀測(cè)思路。

圖5. 光透明顱窗結(jié)合雙光子成像監(jiān)測(cè)皮層樹突棘可塑性[2]。

       研究人員借助光透明顱窗，成功實(shí)現(xiàn)了神經(jīng)元突觸可塑性的觀測(cè)。在建立光透明顱窗后，雙光子成像獲取的神經(jīng)信號(hào)的圖像質(zhì)量得到顯著改善，足以對(duì)樹突棘進(jìn)行清晰地成像。隨后對(duì)小鼠神經(jīng)元樹突棘進(jìn)行持續(xù)觀測(cè)，觀察樹突棘的出現(xiàn)和消失、以及形狀的變化（圖5）。除了高分辨率成像外，顱骨光透明技術(shù)通過(guò)在顱骨表面滴加化學(xué)試劑使顱骨透明，因此可以用于大視場(chǎng)的透明成像。如圖6所示，研究人員可以對(duì)小鼠顱骨頂部進(jìn)行大范圍透明處理，進(jìn)而通過(guò)雙光子成像對(duì)皮層血管和神經(jīng)進(jìn)行大視野和高分辨成像。

圖6. 光透明顱窗結(jié)合雙光子用于大視場(chǎng)、高分辨成像[5]。

       常規(guī)的活體顱骨光透明技術(shù)在光透明顱窗建立過(guò)程中需要先將小鼠麻醉，然后使用化學(xué)試劑進(jìn)行處理，而且成像過(guò)程中液體的化學(xué)試劑需要保持在顱骨表面。但是純粹的液體試劑無(wú)法應(yīng)用于清醒或自由活動(dòng)的小鼠皮層的觀測(cè)。而最新發(fā)展的長(zhǎng)效光透明技術(shù)，光透明顱窗在建立后可以在小鼠顱骨上維持?jǐn)?shù)周，從而可以滿足對(duì)清醒動(dòng)物進(jìn)行成像的需求。借助于這種長(zhǎng)效光透明技術(shù)，研究人員在光透明顱窗建立后2周內(nèi)對(duì)清醒小鼠的神經(jīng)活動(dòng)進(jìn)行了觀測(cè)。在2周的觀測(cè)期間內(nèi)，神經(jīng)元的雙光子成像效果保持良好，可以清晰地通過(guò)鈣信號(hào)變化觀察神經(jīng)元活性。

圖7. 光透明顱窗透明效果的長(zhǎng)期保持（a）及用于清醒動(dòng)物鈣信號(hào)成像（b）[5]。

      與雙光子成像技術(shù)相比，三光子成像技術(shù)擁有更高的空間分辨率。此外，由于三光子熒光與三次諧波發(fā)光所用的激發(fā)波長(zhǎng)相較于雙光子更長(zhǎng)，因此具有更大的成像深度。這些特征使三光子成像在深層組織和高分辨生物成像領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。而活體顱骨光透明技術(shù)同樣可以用于三光子成像。經(jīng)過(guò)顱骨光透明作用后，三光子成像獲取的皮層血管三次諧波信號(hào)得到顯著增加，而且皮層神經(jīng)元成像的深度和對(duì)比度都得到顯著提升（圖8），這為腦皮層深層信號(hào)的獲取提供了有力的手段。

圖8. 光透明顱窗用于三光子成像[4, 5]。（a-c）顱骨光透明作用前后皮層血管白光圖（a）、三次諧波信號(hào)（b）、神經(jīng)元信號(hào)三維重構(gòu)（c）。

（5）光操控

      現(xiàn)代光學(xué)技術(shù)不僅可以獲得高分辨率的神經(jīng)血管圖像，而且可以對(duì)大腦皮層進(jìn)行操控或建立特定的模型�；�于顱骨光透明技術(shù)的窗口，也可替代開(kāi)顱窗和磨薄窗，用于皮層光操控。比如，結(jié)合光透明顱窗和光動(dòng)力效應(yīng)，既可以打開(kāi)血腦屏障，也可以建立靶向缺血性腦卒中模型；此外，透過(guò)光透明顱窗，將飛秒激光聚焦在血管上，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單根血管的燒蝕，從而建立局部靶向的出血性腦卒中模型。

       研究人員利用光透明顱窗，在不開(kāi)顱的情況下實(shí)現(xiàn)了光動(dòng)力效應(yīng)打開(kāi)血腦屏障，并可以在活體水平跟蹤熒光染料的滲漏過(guò)程（圖9. a），隨后進(jìn)一步研究了光動(dòng)力效對(duì)于不同年齡小鼠血腦屏障功能影響的差異性。這些研究為腦藥物遞送和腦疾病的治療提供了一種新的手段。此外，研究人員還將活體顱骨光透明技術(shù)與光栓技術(shù)相結(jié)合，在非開(kāi)顱的情況下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腦皮層血管的靶向栓塞。通過(guò)改變激光照射位置和照射劑量，可以對(duì)栓塞程度和栓塞區(qū)域進(jìn)行調(diào)節(jié)（圖9. b），該模型可以用于評(píng)估溶栓藥物對(duì)不同尺寸血管的溶栓治療效果。

圖9. 顱骨光透明技術(shù)用于皮層光操控[8, 9]。（a）光透明顱窗結(jié)合光動(dòng)力效應(yīng)打開(kāi)血腦

屏障；（b）光透明顱窗結(jié)合光動(dòng)力效應(yīng)實(shí)現(xiàn)光栓模型建立。

展望

      近年來(lái)發(fā)展的顱骨光透明技術(shù)為活體皮層觀測(cè)提供了一個(gè)無(wú)需開(kāi)顱的光學(xué)窗口。隨著光透明顱窗的出現(xiàn)，光聲成像、激光散斑成像、雙光子/三光子成像、近紅外二區(qū)成像、高光譜成像和非線性顯微成像等多種光學(xué)成像技術(shù)被應(yīng)用于活體觀察皮層神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞及血管結(jié)構(gòu)和功能。借助光透明顱窗，可以動(dòng)態(tài)觀測(cè)神經(jīng)突觸可塑性、神經(jīng)元自發(fā)或?qū)Υ碳さ捻憫?yīng)、長(zhǎng)時(shí)程監(jiān)測(cè)血管的修剪與新生、表層與深層的血液流速變化等[10, 11]。此外，光透明顱窗技術(shù)還有望與光學(xué)相干層析成像技術(shù)相結(jié)合，有潛力在無(wú)需標(biāo)記的情況下獲取皮層深組織的血管結(jié)構(gòu)與功能信息。不僅如此，顱骨光透明技術(shù)也為皮層靶向光操控提供了非侵入性的窗口。利用飛秒激光，可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)血管的靶向損傷；結(jié)合光動(dòng)力效應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)血腦屏障的開(kāi)放或建立光栓模型。這也極大的拓展了顱骨光透明技術(shù)的應(yīng)用場(chǎng)景，有望在多種病理模型的研究中發(fā)揮作用。

      隨著顱骨光透明技術(shù)的不斷發(fā)展，至今已有多種光透明顱窗可供選擇。而光透明顱窗發(fā)展至今，已同時(shí)具備了高分辨、大視場(chǎng)、長(zhǎng)時(shí)程、適用于急性觀測(cè)的優(yōu)勢(shì)，因而有望在某些傳統(tǒng)顱窗無(wú)法勝任的場(chǎng)合（比如急性創(chuàng)傷性腦損傷的跨腦區(qū)觀測(cè)，以及顱骨下方腦膜的結(jié)構(gòu)與功能成像）提供重要的技術(shù)支撐，從而在未來(lái)的腦科學(xué)研究中大放異彩。

       誠(chéng)然，目前顱骨光透明技術(shù)依然有所限制。比如，對(duì)于更大動(dòng)物的活體顱骨光透明方法并不完善。對(duì)于大鼠顱骨的活體透明需要先將顱骨磨薄，才能獲得較好的透明效果，目前佳維斯團(tuán)隊(duì)正在先前小鼠顱骨透明技術(shù)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)大鼠顱骨透明技術(shù)，相信不久以后這款新產(chǎn)品也即將推向市場(chǎng)并服務(wù)于廣大科研工作者。而對(duì)于大型靈長(zhǎng)類動(dòng)物（如獼猴），尚未有適用的活體顱骨光透明方法。這需要研究人員繼續(xù)探索更高效的顱骨光透明方法。未來(lái)更有效的顱骨光透明技術(shù)的出現(xiàn)，結(jié)合更多的成像方法（如大視場(chǎng)、高分辨且同時(shí)擁有大景深的光場(chǎng)顯微成像技術(shù)），將會(huì)為腦科學(xué)的發(fā)展提供更有力的技術(shù)保障！

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