Innopsys熒光掃描儀在單細胞western blots檢測中的應用

細胞是生命體最小的組成單位，蛋白質是生命活動的執(zhí)行者，而細胞內蛋白質豐度的變化對各種生命過程有著至關重要的作用，不僅為生命活動提供物質基礎，也是理解細胞功能和發(fā)展過程的中心環(huán)節(jié)。細胞在生長過程中，經過多次分裂增殖，在完成其生命周期的同時也會呈現分子生物學或基因方面的改變，從而產生細胞多樣性即細胞異質性，這是一種普遍存在的生物學現象，即使看起來相同的細胞，也可能存在顯著的差異。而傳統(tǒng)的蛋白質組學是對組織或大量細胞樣本進行分析，獲得的是均質化后的結果，掩蓋了單個細胞的個體差異，而在組織、器官或個體中，細胞具有非常大的異質性，傳統(tǒng)的研究方法不能完全衡量細胞的復雜性、多樣性以及功能差異。同時基于流式的檢測技術，由于很難檢測細胞胞內的蛋白水平以及抗體來源受限，使得這一方法有一定的局限性。

隨著測序技術的發(fā)展，生命科學研究早已進入了單細胞時代，在mRNA水平已經可以很好的從單細胞的維度上探究細胞、組織、器官的發(fā)育過程以及與疾病相關的細胞異質性和同質性問題。但由于基因轉錄水平和蛋白水平相關性并不是很高，也不能完全反映蛋白質的調控作用，所以要更好地理解細胞的調控機制，檢測效應分子蛋白質比mRNA更直接有效，對于理解細胞的功能更為重要。近幾年，基于單細胞蛋白質組技術的方法快速發(fā)展，在很大程度上彌補了單細胞水平蛋白質研究的需求。
 

本文主要介紹一種單細胞蛋白免疫印跡檢測技術(Single cell Westerns Blotting, scWesterns)，是對傳統(tǒng)的蛋白免疫印跡(Western blotting)方法的精細化改進，實現了在單細胞層面上高通量的對于單細胞蛋白質組進行免疫印跡檢測、定量和分析，與傳統(tǒng)的western blots不同，scWesterns方法可以精確量化由外界刺激所引起的單個細胞蛋白質水平的變化。系統(tǒng)組成：scWesterns 檢測試劑、全自動電泳分離系統(tǒng)、數據處理軟件以及Innopsys芯片掃描儀，檢測流程如圖(一)所示。scWesterns實驗整個過程都是在改造的顯微鏡載玻片上進行的，載玻片上有通過軟光刻技術制作而成的可以固定單個細胞的凝膠槽矩陣，每個微孔都可以看作是一個微型的反應器，對細胞矩陣進行明場光學掃描之后，將凝膠槽轉移至微型電泳槽中，進行蛋白凝膠電泳。整個技術可以實現高通量的對單細胞蛋白進行scWesterns檢測和分析。
 

操作流程圖一：1.解凍細胞，吹打混勻，離心重懸制備細胞懸液，細胞濃度為 10,000 - 100,000 個細胞/mL，種植細胞，將 1 mL 單細胞懸液從左到右滴加到芯片上，確保整張芯片都被均勻覆蓋，細胞在重力的作用下會沉降到光敏膠中，室溫靜置 5-20 分鐘，用明場顯微鏡觀察芯片,確保每個block至少有15%-20%細胞占有率，且很少存在單孔雙細胞的狀態(tài)；2.在儀器電泳槽中加入300uL裂解液進行細胞裂解，根據蛋白大小設置參數運行儀器進行電泳分離和蛋白固定；3.稀釋不同種屬的一抗（小鼠，山羊，兔）與芯片進行雜交，室溫孵育 1-2小時，也可4度過夜，孵育后用wash buffer清洗三次，每次10分鐘；稀釋二抗，芯片避光與二抗孵育1小時，孵育后用wash buffer清洗三次，每次10分鐘，最后用去離子水連續(xù)沖洗芯片1分鐘；4.使用Innopsys 1100三色熒光掃描儀（紅、綠、藍）進行熒光信號掃描；5-6.使用分析軟件進行數據處理和分析。
 

結果顯示：采用scWesterns技術對單細胞進行四個靶蛋白檢測，如圖二所示，根據不同蛋白分子量的差異以及雜交不同種屬的一抗和熒光二抗來區(qū)分不同的靶標蛋白，使用Innopsys 1100對紅、綠、藍三種熒光信號進行檢測，發(fā)現細胞對刺激產生了ERK應答反應，同時檢測到了EGFR表皮生長因子受體、以及突變體L858R。
 

圖二：對紅，綠，藍不同熒光標記的目的蛋白（ERK，EGFR,L858R,Tubulin）進行檢測，結果如上圖所示。
 

展望：scWesterns技術可以應用于基礎研究和醫(yī)學領域，包括腫瘤細胞：腫瘤的耐藥基礎研究，惡性腫瘤標志物發(fā)現；免疫細胞：機體免疫狀態(tài)分析以及免疫應答基礎研究；干細胞：干細胞分化發(fā)育研究，精準控制干細胞分化發(fā)育；藥物研發(fā)：量化細胞對藥物制劑的反應。

Innopsys 成立于1999年�？偛课挥诜▏�，一直致力于生物醫(yī)學領域相關儀器和軟件的自主研發(fā)和生產。Innoscan系列掃描儀，采用先進的共聚焦PMT檢測器和多激光掃描光路，可以同時進行多通道熒光檢測。不僅有效降低了熒光光漂白現象以及信號損失，還可以有效縮短掃描時間。在基因組和蛋白組表達，基因突變，SNP檢測，CGH，細菌病毒檢測，腫瘤特異性標志篩查，病理組織篩查等方面都有非常廣泛的應用。

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