DAP-seq技術在金銀花綠原酸生物合成和苯丙素代謝機制研究中的應用

綠原酸(CGA)是灰氈毛忍冬(Lonicera macranthoides，別稱：金銀花)最重要的活性藥物成分，在醫(yī)學領域?qū)μ烊籆GA的需求急劇增長。雖然CGA生物合成的關鍵基因已有報道，但其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制在很大程度上仍然是未知的。因此，研究CGA生物合成的分子調(diào)控機制對于利用基因工程技術培育高CGA含量的金銀花新品種具有重要意義。

2021年4月29日，重慶文理學院園林與生命科學學院陳澤雄教授的研究成果，發(fā)表在植物科學領域的知名學術期刊Plant Science上，文章題目為“A R2R3-MYB transcriptional activator LmMYB15 regulates chlorogenic acid biosynthesis and phenylpropanoid metabolism in Lonicera macranthoides”，該期刊的影響因子為5.363。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq) 技術鑒定了金銀花R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子LmMYB15的DNA結(jié)合基序及其靶基因。進一步研究揭示了LmMYB15調(diào)控金銀花CGA生物合成和苯丙素代謝的分子機制，該研究成果為利用基因工程策略開發(fā)富含CGA的金銀花新品種提供了寶貴的基因資源。

該研究首先通過對金銀花不同發(fā)育時期的不同組織進行質(zhì)譜檢測和轉(zhuǎn)錄圖譜分析，發(fā)現(xiàn)LmMYB3、LmMYB4、LmMYB15和LmMYB31基因與CGA的含量存在顯著的相關性，表明這些基因在調(diào)控CGA生物合成中發(fā)揮潛在作用。LmMYB15和其他MYBs蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明，LmMYB15與紅花CtMYB1、擬南芥AtMYB15和AtMYB14、番茄SlMYB15和菊花CmMYB15具有相近的同源性。酵母雙雜交試驗表明LmMYB15可作為轉(zhuǎn)錄激活因子。在煙草中過表達LmMYB15基因，促使CGA的含量顯著增加，表明LmMYB15是CGA生物合成的正調(diào)控因子。

圖1. DAP-seq分析鑒定全基因組范圍的LmMYB15靶基因

(A) LmMYB15結(jié)合的peaks在基因組上的分布分析。(B) 通過MEME-Chip分析篩選LmMYB15的DNA結(jié)合基序，其中(C/T) (C/T) (C/T) ACCTA(C/A) (C/T) (A/T) (即YYYACCTAMYW) 和 (C/T)ACCTA(C/A)(即YACCTAM)為最集中富集的2個基序。

為了闡明LmMYB15的分子機制，采用DAP-seq技術鑒定了LmMYB15的DNA結(jié)合基序及其直接的下游靶基因，包括4CL、MYB3、MYB4、KNAT6/7、IAA26和ETR2等。酵母單雜交和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，LmMYB15可以結(jié)合4CL、MYB3和MYB4的啟動子，并激活這些基因的表達，從而促進CGA的生物合成和苯丙素代謝。該研究揭示了一種LmMYB15調(diào)控金銀花CGA生物合成的新的分子機制，同時為高CGA含量的金銀花育種策略提供了新途徑，這對于提高金銀花的藥用性能具有重要意義。

圖2. LmMYB15正向調(diào)控CGA生物合成的分子機制模式圖

總結(jié)：該研究從金銀花中分離到一個R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子LmMYB15，它是CGA生物合成的正調(diào)控因子，它直接與下游靶基因的啟動子結(jié)合，包括4CL、MYB3和MYB4，從而促進CGA的積累和苯丙素代謝。該研究為CGA生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制提供了新見解，同時為培育具有更高藥用價值的高CGA含量金銀花新品種提供了新的策略。