酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒的使用方法與應用

一、背景
 
酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒適用于酵母小規(guī)模高純度質(zhì)粒制備。采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞并結合lyticase特異消化酵母細胞壁，能在1小時內(nèi)從酵母培養(yǎng)液中分離出高純度質(zhì)粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除細胞壁后,然后堿裂法裂解細胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低PH值狀態(tài)下選擇性地結合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細菌成分去除，最后低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。
 
二、使用方法
 
1、從-20℃或更低的冰箱中取出血液樣品，室溫下靜置融化。
 
2、將400μL解凍的血液轉移到一個1.5mL的塑料離心管中，加入400μL溶液A，充分震蕩混勻。如果是禽類血液，則少加10倍，只加40μL。
 
3、在混合液中加入400μL溶液B和200μL氯仿(自備)，振蕩1分鐘。由于離心管比較滿，所以需要確保管底溶液轉動起來，否則只是液面振動而已。
 
4、4℃12000 g離心10分鐘，小心將上清轉移至一新的1.5mL塑料離心管中。注意：最好不要室溫離心，如果室溫離心，則離心后部分樣品的中間白色層可能會很厚，只能得到很少的上清。
 
5、將約0.7-0.8mL上清轉移到10-15mL塑料離心管中(不要使用玻璃離心管，否則DNA會吸附到管壁上。常用的培養(yǎng)提質(zhì)粒用的細菌的培養(yǎng)管即可)。
 
6、加入2.5倍上清體積的溶液C(2mL)，立即搖晃混勻。
 
7、將混合液分多次轉移到離心吸附柱中，每次0.7mL左右，轉移后靜置2-5分鐘，以使DNA與膜充分結合，然后室溫12000 g離心30秒，棄收集管中的廢液，然后再加入0.7mL，重復上述操作，直到全部混合液掛柱。
 
8、在離心吸附柱中加入0.7mL通用洗柱液，室溫12000 g離心30秒，棄收集管中的廢液。
 
9、在離心吸附柱中再加入0.3mL通用洗柱液，室溫12000 g離心30秒，棄收集管中的廢液。
 
10、室溫12000 g離心30秒，去盡殘留液體(此步驟十分重要，不要省略，否則殘留的含乙醇的通用洗柱液將抑制后續(xù)的酶反應)。
 
11、將離心吸附柱置于一新的1.5mL塑料離心管中，加入50μL DNA洗脫液2.0，室溫放置2分鐘。如果將DNA洗脫液2.0在65℃預熱后再使用，洗脫DNA的效果更佳。
 
12、室溫12000 g離心30秒，離心管底部溶液即DNA溶液，可立即使用或-20℃長期保存。
 
三、應用
 
用于PRV EPO基因酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒與PK-15細胞cDNA文庫的構建研究：
 
構建了pGBKT7-EP0誘餌質(zhì)粒和PK-15細胞cDNA文庫,為更好的研究PRV EP0蛋白與宿主細胞PK-15之間的相互作用機制提供基礎。
 
具體研究內(nèi)容如下：第一部分：構建pGBKT7-EP0誘餌質(zhì)粒采用PCR技術,擴增獲得PRVEP0基因,將其克隆至酵母雙雜交載體pGBKT7中,獲得重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EP0,通過限制性內(nèi)切酶EcoRI與Pst I雙酶切鑒定與基因測序結果分析,表明成功構建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EP0。將該質(zhì)粒轉入到Y2HGold酵母感受態(tài)細胞中,對其進行毒性檢測,自激活效應檢測,PCR以及Western-blot檢測,結果表明誘餌質(zhì)粒表達的產(chǎn)物對酵母細胞無毒性作用,無自激活效應,PCR和Western-blot檢測結果證實誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EP0成功轉入酵母細胞,并且能夠表達融合蛋白BD-EP0-Myc。
 
第二部分：PK-15細胞cDNA文庫構建及鑒定選取PRV的宿主細胞PK-15細胞來構建酵母雙雜交cDNA文庫。本試驗從PK-15細胞提取總RNA,采用SMART和LD-PCR合成全長的ds cDNA,并對其進行均一化和SfiⅠ酶切處理。將得到的dscDNA連接到三框表達載體中。將這三個重組反應產(chǎn)物用電轉化方法轉入到HST08電轉化感受態(tài)細胞中,構建含有三種讀碼框的初級文庫,該文庫庫容分別為3.0X 106、2.0×106和2.0×106 CFU,插入片段均在500bp以上,陽性重組率均大于93%。再將三框初級文庫共同電轉化至感受態(tài)細胞HST08中進行擴增,提取質(zhì)粒文庫。最后將質(zhì)粒文庫轉化到Y187酵母感受態(tài)細胞,得到的cDNA酵母文庫總庫容量為7.5×105 CFU,基本符合酵母雙雜交cDNA文庫構建要求。
 
綜上,成功構建了符合酵母雙雜交篩選要求的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-EP0和酵母cDNA文庫,為進一步研究PRV EPO蛋白與PK-15細胞蛋白之間的相互作用奠定了基礎。