醫(yī)學(xué)1區(qū)：DESI-MS脂質(zhì)代謝組學(xué)精準(zhǔn)探究視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤調(diào)節(jié)治療作用

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（RB）是一種兒童眼內(nèi)腫瘤，如果不治療，會(huì)導(dǎo)致完全失明，并在晚期嚴(yán)重時(shí)死亡，近年來(lái)科學(xué)家通過(guò)開發(fā)針對(duì)RB細(xì)胞的靶向治療來(lái)拯救患兒的視力和生命。視網(wǎng)膜主要由甘油磷脂組成，進(jìn)一步可分類為磷脂（PE）和磷脂酰膽堿（PC）。用質(zhì)譜成像技術(shù)（DESI MS）進(jìn)行脂質(zhì)成像檢測(cè)是精確測(cè)量組織代謝產(chǎn)物和研究正常和癌變組織之間脂質(zhì)變化的強(qiáng)有力的手段之一。基于DESI MS的脂質(zhì)成像有助于視網(wǎng)膜疾病的研究，本篇文章主要以視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（RB）作為研究對(duì)象，通過(guò)DESI-MS和免疫組學(xué)等技術(shù)，更深入地探究了NCL-APT核糖核酸酶適體對(duì)RB的調(diào)節(jié)治療作用。
 

Kamalnayan Bajaj視力和眼科研究的Subramanian Krishnakumar教授在Molecular Therapy—Nucleic Acids發(fā)表的題為 “Nucleolin-aptamer therapy in retinoblastoma: molecular changes and mass spectrometry–based imaging ”（IF：11.454）的研究成果，通過(guò)DESI-MS成像技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、qPCR、免疫組織化學(xué)、免疫印跡分析等技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了核仁適體(NCL-APT)治療RB特征，探究了NCL-APT調(diào)節(jié)RB機(jī)理，描繪了NCL-APT的DESI-MS脂質(zhì)成像圖譜，為NCL-APT的RB靶向治療提供了理論依據(jù)。
 

1. RB中NCL的表達(dá)和NCL-APT的攝取

通過(guò)qPCR、免疫組織化學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡分析RB腫瘤樣本的NCL，發(fā)現(xiàn)RB細(xì)胞系Y79和WERI-Rb1和RB腫瘤細(xì)胞質(zhì)中的NCL均顯著上調(diào)。RB腫瘤細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞表面的NCL水平升高，可有助于攝取RB腫瘤細(xì)胞中的NCL-APT。NCL-APT周期變化中，WERI-Rb1的G0-G1期增加，Y79的S期停滯。表明NCL在RB細(xì)胞和細(xì)胞系中差異表達(dá)，NCL-APT產(chǎn)生周期性變化（圖1）。

圖1 核仁素在RB腫瘤樣本和細(xì)胞系中的表達(dá)

2. NCL-APT調(diào)節(jié)RB中的致癌miRNA

作者研究NCL-APT對(duì)RB的miRNA表達(dá)影響。通過(guò)微陣列分析，顯示miRNA顯著下調(diào)。NCL-APT處理后miRNA仍下調(diào)，qPCR在WERI-Rb1細(xì)胞中作用顯著。說(shuō)明miRNA譜中其他下調(diào)的miRNA表達(dá)變化也得到了驗(yàn)證（圖2）。

 圖2 NCL-APT對(duì)miRNA表達(dá)的影響

3. NCL-APT在體外和體內(nèi)干擾RB：對(duì)miRNA、凋亡蛋白的影響

作者采用MTT研究RB、MIO-M1細(xì)胞系中NCL-APT生長(zhǎng)和增殖。但細(xì)胞分裂的抑制導(dǎo)致細(xì)胞毒性，使RB細(xì)胞系的生存能力降低。通過(guò)RB和MIO-M1細(xì)胞系的細(xì)胞活力測(cè)試，證實(shí)了NCL-APT活性的特異性（圖3）。

圖3 NCL-APT對(duì)細(xì)胞增殖的影響

NCL-APT和LNA-NCL-APT在Y79異種移植小鼠的腫瘤部位附近皮下（皮下）治療，顯示腫瘤生長(zhǎng)減少。說(shuō)明不同治療中切除的腫瘤大小差異明顯（圖4）。

圖4 NCL-APT和LNA-NCL-APT的Y79異種移植物模型

采用微陣列觀察NCL-APT處理的miRNA，發(fā)現(xiàn)miRNA在異種移植的腫瘤組織中被下調(diào)。表明NCL-APT對(duì)miRNA的影響導(dǎo)致腫瘤發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)通過(guò)正常裸鼠血清miRNA與Y79異種移植小鼠血清相比，顯示miR-18a和miR-19b-1表達(dá)水平升高。NCL-APT皮下注射和LNA-NCL-APT腹腔注射組比較發(fā)現(xiàn)，所有治療組中miR-18a表達(dá)受影響程度相似。免疫印跡分析顯示，不同模式下FOXM1表達(dá)不同，但表達(dá)均下調(diào)。說(shuō)明體外和體內(nèi)NCL-APT治療對(duì)RB生長(zhǎng)的抑制是由mRNA、致癌miRNA和凋亡標(biāo)志物進(jìn)行整合調(diào)節(jié)介導(dǎo)的（圖5）。

圖5 Y79異種移植物上NCL-APT和

LNA-NCL-APT治療后的分子變化

4. LNA-NCL-APT介導(dǎo)的凋亡標(biāo)志物變化和細(xì)胞因子水平：整合體分析

LNA-NCL-APT處理的異種移植物中腫瘤凋亡蛋白和細(xì)胞因子發(fā)生變化。蛋白質(zhì)陣列用PBS和LNA-NCL-APT處理的腫瘤組織研究凋亡標(biāo)記物，顯示外源性和內(nèi)源性途徑介質(zhì)的顯著差異。LNA-NCL-APT治療中，趨化細(xì)胞因子和促有絲分裂細(xì)胞因子混合表達(dá)。LNA-NCL-APT腹腔注射治療組織的IHC研究也顯示細(xì)胞核PCNA表達(dá)水平下降。綜合網(wǎng)絡(luò)建模和分析，揭示了關(guān)鍵途徑、基因等在NCL-APT治療過(guò)程中的變化（圖5）。

5. 異種移植組織的脂質(zhì)譜分析

通過(guò)MS/MS和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，在DESI  MS中不同RB細(xì)胞系中觀察到的高強(qiáng)度峰，與未處理組相比有顯著差異（圖6）。NCL-APT和LNA-NCL-APT治療Y79異種移植物，分析皮下注射和腹腔注射的脂質(zhì)質(zhì)譜。腫瘤切片分析顯示NCL-APT皮下注射的脂質(zhì)強(qiáng)度降低，少數(shù)組織區(qū)域變化不明顯（圖7）。說(shuō)明脂質(zhì)水平的變化與適體有關(guān)，因?yàn)橹�質(zhì)合成的抑制或水平的降低直接影響細(xì)胞增殖。

圖6 RB細(xì)胞系DESI MS成像

圖7 NCL-APT和LNA-NCL-APT體內(nèi)評(píng)估后PC水平的變化

通過(guò)免疫組學(xué)、質(zhì)譜成像（DESI-MS）等技術(shù)，探究NCL-APT對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（RB）的表達(dá)和治療。通過(guò)體外、體內(nèi)NCL-APT對(duì)RB的影響，說(shuō)明通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA、致癌miRNA和凋亡標(biāo)志物可抑制RB生長(zhǎng)。脂質(zhì)合成的抑制或水平的降低也直接影響RB的細(xì)胞增殖。同時(shí)，也進(jìn)一步證實(shí)了NCL-APT治療RB的有效性，也為RB的靶向治療提供新思路。

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定性結(jié)果同時(shí)考慮物質(zhì)表達(dá)空間情況、加和離子及同位素峰表達(dá)強(qiáng)度相似性、同位素表達(dá)空間分布相似性、非靶向質(zhì)譜數(shù)據(jù)和空代自建數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行校準(zhǔn)。

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無(wú)偏好性檢測(cè)代謝物：:70%為700Da以下的小分子物質(zhì)，30%為脂質(zhì)類物質(zhì)，更加適合代謝組學(xué)研究方向。