Western Blot驗證蛋白表達情況

一．Western Blot實驗原理
利用SDS-PAGE技術(shù)對蛋白質(zhì)多肽樣品直接進行電泳分離，轉(zhuǎn)移多肽/蛋白吸附到固相載體表面材料（如硝酸纖維素薄膜）上（以非共價鍵形式），并保持電泳分離的多肽/蛋白的類型及其生物學活性不變。以固相載體上所附著的固定的蛋白質(zhì)/多肽分子片段作為載體抗原，與對應的抗體起免疫反應，再分別通過放射性同位素標記載體上抗原的二抗起免疫結(jié)合反應，經(jīng)過熒光吸收顯色技術(shù)或熒光放射同位素自凝顯影等技術(shù)可以分離所得到目的蛋白。
 
二．Western Blot實驗流程
（一）配膠：配置分離儲備膠，ddH2O 4.0 mL、30%儲備膠3.3 mL 1.5 M Tris-HCl 2.5 mL、10% SDS 0.1 mL、10%APS膠0.1 mL。取上述兩種混合液，加以TEMED(N'N'N'N'-四甲基乙二胺)10 μL封底，再加 TEMED 4 μL，混攪勻后灌人入玻璃板槽內(nèi)，再加約20%左右的乙醇封頂，注意勿使玻璃液面偏平。配置濃縮膠，ddH₂O 1.4 mL、30%儲備膠0.33 mL、1 M Tris-HCl 0.25 mL、10%SDS 0.02 mL、10%APS 0.02 mL、TEMED 2μL。將分離后膠杯內(nèi)壁上的殘存剩余的膠水液傾倒下去，加入了上述剩余的膠混臺液，立即用力將梳子輕輕插入玻璃板孔道間，完全聚合好后還需再放置大約15-30個min，在再插拔梳子時還要注意要防止有大量氣泡液體直接流進入梳孔孔內(nèi)而導致使整個梳孔變形。
（二）樣品處理
1.培養(yǎng)的細胞（定性）
去除培養(yǎng)液細胞后一定要馬上用溫的PBS液反復沖洗每個細胞的2至3遍為止（冷的PBS有可能使細胞脫落）。對于6孔板來說每一個孔都要再加200至300 uL，60至80℃1個×loading buffer。刮去除下去的細胞一定要先在EP管中煮沸約10 min，期間一定要渦旋震蕩2至3次。用最后一根清潔干凈后的針尖再次進行挑絲，將團塊絲全部棄掉，如果您發(fā)現(xiàn)沒有絲狀團塊的存在但絲又有了明顯的拉絲現(xiàn)象的現(xiàn)象，可再考慮下將EP管置于0℃后在分別用14000至16000 g進行離心和振蕩約2 min，再次進行挑絲。若樣品上無明顯拉絲團塊或者也是雖然無明顯白色絲狀物團存在但樣品溶液里仍然會有些粘稠，可首先通過連續(xù)使用一支1 mL流量的注射器來進行連續(xù)反復多次的抽吸試驗來達到適當降低樣品溶液粘滯度，便于在下次進行上樣。待樣品溶液逐漸穩(wěn)定恢復樣品溫度穩(wěn)定到正常的室溫以下后再次上樣。
2.培養(yǎng)的細胞（定量）
加入適量的冰預冷后的裂解液混勻后置于冰上10~20 min。刮除取下的細胞液后收集在EP管腔內(nèi)混勻后注入超聲。12000 g后進行離心，4℃，2 min。取下的少量的上廓清液進行定量。將以上的所有的蛋白樣品濃度均調(diào)至等質(zhì)量比的濃度,充分均勻的攪拌混合至沉淀后在滴加loading buffer溶液后如果再能直接地進行上樣的反應是最好,剩余的溶液（溶于1×loading buffer）后就完全可以繼續(xù)用低溫儲存。
3. 組織
心肝脾腎等臟器組織可考慮采用每50至100 mg再加1 mL裂解液，肺組織每100至200 mg后再酌情加用1 mL裂解液。可分別通過手動攪拌或單獨用電動攪拌機打勻成漿。注意攪拌機要注意盡量避免長時間和保持較低溫，快速均勻攪拌才能勻漿。將所有混合的蛋白樣品溫度都調(diào)至一致濃度，充分加熱溶解混合蛋白沉淀液后在加滿loading buffer后再開始直接加熱攪拌直到上樣濃度為最好，注意低溫儲存處理好后剩余蛋白溶液。
（三）SDS-PAGE電泳
上樣檢驗工作完畢，在電泳槽溶液漏斗中加入電泳緩沖液，連接電源，負極在上，正極溶液在下。電泳時，濃縮溶膠電壓約為80 V，分離膠電壓大約是120 V，電泳繼續(xù)進行至溴酚藍行至電泳橫條的下端停止。
（四）轉(zhuǎn)膜
1.前準備好轉(zhuǎn)移膜的緩沖液、轉(zhuǎn)膜時用的兩個小塑料夾子、兩塊塑料海綿墊、一只滴管、一張PVDF轉(zhuǎn)移膜、2大張濾紙。切濾紙膜板和濾膜時手均須要事先戴并帶好的一次性橡皮手套，PVDF濾膜板先切應預先放置在稀甲醇的溶液中并充分浸泡至少5-10秒，接著再放入平衡液中平衡。
2.取出SDS-PAGE膠，將濃縮膠輕輕向上刮數(shù)下，在膠的一角處做標記以方便區(qū)分上樣的順序。放在轉(zhuǎn)膜緩沖液槽中浸泡大約5分鐘以重新平衡離子強度。
3.夾子打開并垂直平放到底部的一個黑色電極盒內(nèi)（陰極）的中間，放進另有一張的黑色海綿墊片，用另一張玻棒子來回反復的搟打幾遍以幫助均勻地趕走氣泡。取出全部已均勻浸泡在轉(zhuǎn)膜液槽中的剩余凝膠并重新平躺地放在凝膠濾紙板片上，排除掉了所有殘余氣泡。將PVDF轉(zhuǎn)移凝膠膜置于聚丙烯酰胺轉(zhuǎn)移凝膠槽板上，玻棒一定要來回的刮壓幾遍以便能排除去的所有氣泡，注意一定須能在轉(zhuǎn)移凝膠膜槽板的最上端正面作上標記（可以將膜的一角剪去或用簽字筆在膜的邊角上做記號）。在轉(zhuǎn)移膜板蓋上先應先蓋好另一張已經(jīng)過轉(zhuǎn)移膜緩沖液槽浸泡及清洗處理過后的透明濾紙，亦是須確保轉(zhuǎn)移膜內(nèi)不留任何氣泡。最后再板蓋上應另取另外一張透明海綿墊,蓋上陽極板蓋（白色）后，夾緊，保證對凝膠層產(chǎn)生一定壓力。4.將夾子放入轉(zhuǎn)移膜槽中，轉(zhuǎn)膜時還需再將被轉(zhuǎn)移膜槽放入冰水中循環(huán)進行。一般是用恒壓110 V轉(zhuǎn)移時間約在60 min。特別提示實驗要保證低溫進行。
(四）免疫學檢測
1.取膜，將此膜片的一端正面朝上在1xPBST溶液容器中輕輕上下?lián)u動約五分鐘，洗三次，移至含有封閉液瓶（如含10%脫脂濃縮奶粉的瓶PBST緩沖液容器中保存；稱取脫脂濃縮的奶粉重量約是5 g，PBST約100 mL，溶解均勻后置于冰箱4℃小時以下保存。使用完畢取出時，恢復膜在室溫，用量輕輕蓋過此膜面即可。）放在密封良好的玻璃平皿瓶腔中，室溫狀態(tài)條件下放置在脫色搖床上搖動并封閉保存超過1h。
2.取出膜在1xPBST溶液浴中搖動清洗約5分鐘，洗三次，放入1xPBST緩沖液槽中培養(yǎng)（內(nèi)含5%脫脂牛奶），同時分別加入一抗與二抗到緩沖液槽中，孵育間隔60 min。
3.用1xPBST洗至少三次，5 min/次。
4.化學發(fā)光，顯影。 圖1 WB基本流程（來自卡梅德官網(wǎng)）
卡梅德生物在實驗操作細節(jié)上具有總結(jié)的技巧，有著嚴格質(zhì)控點，嚴謹?shù)念A實驗設置，能夠針對不同客戶的樣品量身定制不同的實驗方案，并提供清晰、完整的Western Blot實驗結(jié)果，節(jié)省客戶寶貴的科研時間，以高質(zhì)量滿足客戶需求。
 
三.傳統(tǒng)濕轉(zhuǎn)與半干轉(zhuǎn)的對比
100KD以下蛋白適用半干轉(zhuǎn)，且半干轉(zhuǎn)速率快。因為半干轉(zhuǎn)的電流不會側(cè)漏，全都在濾紙之間，所以轉(zhuǎn)的效率比較高，速度快，缺點是有效離子濃度衰減快，可能大蛋白沒來得及轉(zhuǎn)上，產(chǎn)熱大可能被燒糊。
100KD以上的大分子蛋白的轉(zhuǎn)膜適合用濕轉(zhuǎn)方式，濕轉(zhuǎn)有效電流少，不全在濾紙之間，會從緩沖液間側(cè)漏，所以轉(zhuǎn)的效率低下，速度就慢了，但是有效離子濃度高，能夠長時間進行轉(zhuǎn)膜。

四.內(nèi)參抗體的選擇
(一）考慮實驗樣本來源
1.哺乳動物組織或細胞樣本：常選用β-actin、β-tubulin、 GAPDH、 Lamin B、Histone H3、Na/K ATPase等。
2.植物來源的實驗樣本，可以選擇plant actin、Rubisco等。
3.其他來源樣本研究較少，需要參照文獻報導選用合適抗體。
（二）目的蛋白的分子量大�。�
通常應該保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5 kDa以上。
（三）目的蛋白的表達部位：
一般實驗主要是為了準確檢測胞內(nèi)表達的特異性蛋白，選擇β-actin、 β-Tubulin、 GAPDH的抗體就可以了；而對于核蛋白的定量，特別是樣本來源于細胞核內(nèi)蛋白時，常用的核內(nèi)參抗體有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常見的核蛋白內(nèi)參還有PCNA、K70、 K80等，在一些文獻報道中，Erk2、 TATA binding protein（TBP）以及c-Jun、c-Fos等都有使用；對于膜蛋白檢測，最常用的內(nèi)參抗體為Na/K ATPase；對于線粒體蛋白的檢測，常用VDAC1和COX IV作為內(nèi)參抗體。
 （五）Western Blot實驗的應用
1.研究目的蛋白所處的細胞定位。蛋白的分選投遞與最終發(fā)揮生物功能是受基因活動調(diào)控決定的綜合結(jié)果，因此改變了某些基因的活性，或化學修飾可能會影響其效應蛋白的轉(zhuǎn)運，改變細胞核質(zhì)中的分布，引發(fā)一系列不同的生物學效應。
2.對基因的功能缺失研究。通過敲減或過表達目的基因后，用WB技術(shù)檢測相關(guān)通路蛋白的表達變化，以確定目的基因激活或抑制目的蛋白的表達調(diào)控關(guān)系，探究信號通路。
3.檢測細胞中目的蛋白的表達：通過WB技術(shù)直接檢測干細胞分化、細胞自噬、細胞凋亡、周期蛋白、DNA損傷修復、分子診斷標志物等關(guān)鍵通路蛋白，可評估細胞或機體所處的生物學狀態(tài)。
4.藥物處理、代謝類的研究。
5.蛋白相互作用類的研究。通過WB可檢測Co-IP、RIP、CHIRP等實驗的IP產(chǎn)物，研究目標蛋白-蛋白，RNA-蛋白之間的相互作用。