肝臟模型的3D共培養(yǎng)及其在藥物研究中的應(yīng)用

肝臟是人體最大的消化腺，負(fù)責(zé)合成、代謝、分解、解毒等500多種功能。它主要由肝細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞組成，如肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）、肝星狀細(xì)胞（HSCs）和Kupffer細(xì)胞（KCs），它們通過直接或間接的細(xì)胞串?dāng)_事件共同調(diào)節(jié)肝功能。

體外肝臟模型，包括2D和3D肝細(xì)胞單一培養(yǎng)和共培養(yǎng)模型，在成本、倫理考慮和效率方面比動(dòng)物模型具有優(yōu)勢(shì)。然而，2D肝細(xì)胞模型缺乏生理相關(guān)性，而3D肝細(xì)胞單一培養(yǎng)模型無法代表實(shí)質(zhì)和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的復(fù)雜相互作用。因此，模擬天然肝組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞相互作用的3D共培養(yǎng)肝臟模型的開發(fā)為更準(zhǔn)確地體外預(yù)測(cè)人類藥物反應(yīng)敏感性提供了潛力。以前常用的預(yù)測(cè)工具往往無法可靠地預(yù)測(cè)藥物在人體中的療效和毒性，導(dǎo)致藥物開發(fā)中的高損耗率。3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型可以更好地預(yù)測(cè)人類藥物反應(yīng)，并已在許多研究中用于預(yù)測(cè)候選或上市藥物的體內(nèi)代謝和清除。

在遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、英國(guó)癌癥研究中心曼徹斯特研究所的一項(xiàng)聯(lián)合研究中，在討論肝臟原代實(shí)質(zhì)和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)上，分析了3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型在藥物研究中的潛在優(yōu)勢(shì)；然后介紹了3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型中肝細(xì)胞的主要來源以及構(gòu)建3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型的常用方法；最后討論了具有不同功能的3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟系統(tǒng)及其應(yīng)用。
 

肝臟的主要細(xì)胞成分及其功能

具有六邊形結(jié)構(gòu)的肝小葉構(gòu)成了肝臟的基本結(jié)構(gòu)和功能單位（圖1）。中央靜脈貫穿每個(gè)小葉的中心，負(fù)責(zé)運(yùn)輸肝內(nèi)代謝物。小葉周圍是門靜脈三聯(lián)體，由肝門靜脈、肝動(dòng)脈和膽管組成。肝門靜脈將營(yíng)養(yǎng)豐富的血液輸送到肝臟，而肝動(dòng)脈則向肝臟供氧。

肝細(xì)胞是肝臟中最豐富的細(xì)胞類型，它們形成從中央靜脈向外輻射的肝細(xì)胞板。相鄰的肝板之間所形成的腔隙，就是肝臟非常重要的生理解剖結(jié)構(gòu)，即肝血竇。膽小管由兩個(gè)鄰近的肝細(xì)胞之間的間隙所形成，能夠分泌、輸送膽汁。肝小葉的結(jié)構(gòu)和功能是由各種肝細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用所調(diào)節(jié)的。

圖1   肝小葉結(jié)構(gòu)示意圖。

 

3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型在藥物評(píng)估中的潛在優(yōu)勢(shì)

3D系統(tǒng)可以是自聚集的細(xì)胞球體，由天然或合成材料制成的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）樣3D網(wǎng)絡(luò)支架，以及使用3D技術(shù)構(gòu)建的器官樣系統(tǒng)，其具有氧氣，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和各種生物因子梯度和3D組織結(jié)構(gòu)，可以發(fā)生細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-ECM相互作用。這種培養(yǎng)模式更接近體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境，在很大程度上有助于改善體外肝細(xì)胞的功能活性。

然而，人們逐漸意識(shí)到，3D肝細(xì)胞單一培養(yǎng)模型忽略了肝組織中異型細(xì)胞的直接或間接信號(hào)交換。因此，整合肝異型細(xì)胞相互作用和3D微環(huán)境信號(hào)傳導(dǎo)的3D共培養(yǎng)肝臟模型脫穎而出，具有許多優(yōu)點(diǎn)。多項(xiàng)研究表明，在藥物誘導(dǎo)的肝毒性、肝藥物代謝和藥物相互作用研究中，3D 細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型比 2D 和 3D 單培養(yǎng)和 2D 共培養(yǎng)表現(xiàn)出更好的預(yù)測(cè)能力，因?yàn)?3D 細(xì)胞共培養(yǎng)中的細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境和異型細(xì)胞之間的信號(hào)調(diào)控使它們?cè)隗w內(nèi)表現(xiàn)出更相關(guān)的肝臟環(huán)境和表型，如可復(fù)制的肝竇結(jié)構(gòu)、肝細(xì)胞活性和功能的長(zhǎng)期維持、以及與肝臟特異性功能相關(guān)的基因表達(dá)的增加。Al Hrout等人構(gòu)建的肝癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的3D共培養(yǎng)模型，與肝癌細(xì)胞的2D或3D單培養(yǎng)相比，肝癌細(xì)胞發(fā)展相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)增加，預(yù)后較差，且更接近肝癌在體內(nèi)的發(fā)育特征，有助于更準(zhǔn)確地評(píng)估體外抗癌藥物的抗癌作用。總之，3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型可有效提高肝細(xì)胞體外功能穩(wěn)定性，保證體外藥物預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，有望為藥物研究提供可靠的新平臺(tái)。

 

3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型的肝細(xì)胞來源

1. 原代肝細(xì)胞

原代肝細(xì)胞（PHs）被廣泛認(rèn)為是構(gòu)建體外肝臟模型的金標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物和人源肝細(xì)胞都被使用。特別是原代人肝細(xì)胞（PHHs），由于其分泌特性和代謝酶活性與體內(nèi)肝細(xì)胞相當(dāng)，能夠可靠地反映體內(nèi)肝臟特性，因此在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究人員的青睞。然而，其功能特性的穩(wěn)定表達(dá)高度依賴于微環(huán)境的信號(hào)調(diào)控，這意味著PHHs在單一的2D環(huán)境下會(huì)迅速經(jīng)歷表型變化、細(xì)胞活性下降和細(xì)胞膜極性喪失。為了增強(qiáng)PHHs的功能活性，有研究分別利用由Matrigel和3D生物打印模型組成的3D培養(yǎng)環(huán)境對(duì)PHHs的體外培養(yǎng)條件進(jìn)行了改進(jìn)。這些研究表明，PHHs可以維持其形態(tài)和功能數(shù)月，并改善對(duì)肝毒性藥物的敏感性。

2. 肝癌細(xì)胞系

HepaRG、HepG2、Huh7和Hep3B是用于構(gòu)建體外肝臟模型的常見肝細(xì)胞癌來源細(xì)胞系，因?yàn)樗鼈円子讷@得、易于培養(yǎng)、增殖性高且表型穩(wěn)定，與PHHs相比，供體間變異性較小。然而，這些細(xì)胞系的高增殖潛力通常伴隨著低分化表型，這導(dǎo)致缺乏特定的肝功能，特別是在酶表達(dá)水平（特別是參與藥物代謝的I期和II期代謝酶）、蛋白質(zhì)和尿素合成方面，以及對(duì)毒性反應(yīng)的敏感性遠(yuǎn)低于PHHs。

3. 干細(xì)胞

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（HiPSCs）、胚胎干細(xì)胞（ESCs）和成體干細(xì)胞（ASCs），如間充質(zhì)干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞和造血干細(xì)胞，在體外表現(xiàn)出強(qiáng)大的自我復(fù)制和自我更新能力。特別是HiPSCs和ESCs，在某些條件下具有分化成人體中幾乎任何細(xì)胞類型的潛力。此外，HiPSCs可以從患者活檢中獲得，用于個(gè)性化研究。在全球肝臟供體稀缺的背景下，在特定條件下能夠分化成肝細(xì)胞樣細(xì)胞的干細(xì)胞可以作為肝病治療，再生和體外建模的潛在資源.然而，干細(xì)胞在體外很難分化成功能成熟的肝細(xì)胞，并且可能存在免疫排斥和資源短缺等挑戰(zhàn)。

3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型的常用共培養(yǎng)方法

1. 直接 3D 共培養(yǎng)

直接3D共培養(yǎng)涉及將兩種或多種不同類型的肝細(xì)胞混合成自組裝球體，或在模擬天然肝組織結(jié)構(gòu)的3D環(huán)境中將它們一起培養(yǎng)（圖2）。直接 3D 共培養(yǎng)允許不同肝細(xì)胞之間的密切接觸，從而通過直接細(xì)胞-細(xì)胞粘附、可溶性細(xì)胞因子的旁分泌、細(xì)胞-ECM 粘附和其他機(jī)制實(shí)現(xiàn)它們之間的信號(hào)通信。在像肝臟這樣的多細(xì)胞器官中，異型細(xì)胞之間的直接接觸在肝功能的充分發(fā)揮中起著重要作用。然而，在決定直接共培養(yǎng)的合理性時(shí)，重要的是要考慮體內(nèi)肝組織中共培養(yǎng)細(xì)胞的實(shí)際分布。在體內(nèi)通常沒有直接接觸的細(xì)胞類型的體外直接接觸共培養(yǎng)可能是不必要的。此外，異型細(xì)胞之間的緊密連接也會(huì)影響細(xì)胞分離的難度，這對(duì)于需要單細(xì)胞類型分析的實(shí)驗(yàn)可能是不利的。因此，使用直接共培養(yǎng)的決定應(yīng)基于共培養(yǎng)細(xì)胞的類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

圖2   直接3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型的示例。

（A）混合細(xì)胞球狀共培養(yǎng)系統(tǒng)。（二）3D支架共培養(yǎng)。

 

2. 間接 3D 共培養(yǎng)

間接 3D 共培養(yǎng)涉及在具有物理分離系統(tǒng)的3D環(huán)境中培養(yǎng)兩種或兩種以上類型的肝細(xì)胞（圖3），不允許存在于物理分離系統(tǒng)兩側(cè)的細(xì)胞之間直接接觸，它們之間的信號(hào)通過可溶性細(xì)胞因子進(jìn)行通信。物理分離系統(tǒng)的常見材料是Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板和各種天然或合成材料。此外，一些研究人員還利用3D生物打印技術(shù)實(shí)現(xiàn)了HepG2和NIH/3T3成纖維細(xì)胞的間接3D共培養(yǎng)。他們證明，與HepG2的單培養(yǎng)相比，HepG2和NIH/3T3成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)表現(xiàn)出更好的肝細(xì)胞功能。間接共培養(yǎng)系統(tǒng)可以有效避免不必要的細(xì)胞接觸，促進(jìn)共培養(yǎng)異型細(xì)胞的分離，并可能成為研究體內(nèi)非接觸性肝細(xì)胞通訊的有前途的工具。

圖3   間接3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型的示例。

 

3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型的類型

1. 增強(qiáng)肝細(xì)胞功能的3D細(xì)胞共培養(yǎng)模型

在肝組織中，肝細(xì)胞被LSECs 形成的肝竇網(wǎng)絡(luò)包圍，作為肝細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)交換的基礎(chǔ)，對(duì)維持肝細(xì)胞活性和功能穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。LSECs和肝細(xì)胞的體外共培養(yǎng)已被證明能夠?qū)崿F(xiàn)血管化的3D肝組織結(jié)構(gòu)，其中血管樣管狀網(wǎng)絡(luò)的存在提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，以支持體外肝細(xì)胞的功能并維持代謝廢物的消除。此外，LSECs可通過Id1通路誘導(dǎo)血管分泌因子Wnt2和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）上調(diào)，這兩者都對(duì)肝細(xì)胞增殖至關(guān)重要�？傊�，在3D環(huán)境下，LSECs與肝細(xì)胞共培養(yǎng)可以重現(xiàn)體內(nèi)肝竇的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，這對(duì)體外增強(qiáng)肝細(xì)胞功能的研究具有重要意義。

2. 肝纖維化的3D細(xì)胞共培養(yǎng)模型

肝纖維化是一種肝臟疾病，其特征是肝臟中積累過多的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。近年來開發(fā)了一系列與體內(nèi)相關(guān)的3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝纖維模型。體內(nèi)肝纖維化受多種肝細(xì)胞調(diào)節(jié)，包括HSCs、肝細(xì)胞、LSECs 和KCs。然而，目前肝纖維化的共培養(yǎng)模型有限，只有少數(shù)研究報(bào)告了LSECs與HSCs、肝細(xì)胞和/或KCs的共培養(yǎng)，以建立肝纖維化的體外模型。因此，未來的研究必須將不同類型的肝細(xì)胞整合到3D環(huán)境中進(jìn)行共培養(yǎng)，以構(gòu)建更具代表性的肝纖維化體外模型。

3. 藥物性肝損傷的3D細(xì)胞共培養(yǎng)模型

肝細(xì)胞由于其獨(dú)特的功能活性，通常被用作藥物篩選模型的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，KCs作為肝臟駐留巨噬細(xì)胞群的作用不容忽視，特別是在免疫介導(dǎo)的藥物誘導(dǎo)性肝損傷中，因?yàn)樗鼈兙哂杏行У那宄�和吞噬功能。KCs在肝毒性反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，包含肝細(xì)胞和KCs的3D共培養(yǎng)系統(tǒng)有可能為未來臨床前藥物誘導(dǎo)的肝毒性評(píng)估提供更準(zhǔn)確和有效的工具。然而，需要更多的研究來確認(rèn)這些共培養(yǎng)系統(tǒng)在毒性藥物篩選中的一般應(yīng)用的功能特性。

 

總之，具有更復(fù)雜的細(xì)胞通訊和微環(huán)境特征的3D細(xì)胞共培養(yǎng)肝臟模型將成為未來藥物開發(fā)和篩選研究的有力工具，提高體外藥物評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)的可靠性。解決肝細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的挑戰(zhàn)并進(jìn)一步開發(fā)肝臟ECM樣細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和微流控芯片是朝著這個(gè)方向邁出的重要一步。

參考文獻(xiàn)：Ma Y, Hu L, Tang J, Guo W, Feng Y, Liu Y, Tang F. Three-Dimensional Cell Co-Culture Liver Models and Their Applications in Pharmaceutical Research. Int J Mol Sci. 2023 Mar 26;24(7):6248. doi: 10.3390/ijms24076248. PMID: 37047220; PMCID: PMC10094553.
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