使用細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)胰腺癌基質(zhì)介導(dǎo)的化學(xué)耐藥性進(jìn)行患者特異性建模

胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）是最具侵襲性的惡性腫瘤之一，化學(xué)耐藥性是導(dǎo)致胰腺癌患者預(yù)后不良的主要因素。全身化療是控制疾病的主要治療手段，但是傳統(tǒng)的單藥或聯(lián)合化療方案均未顯示出令人滿意的療效。PDAC腫瘤微環(huán)境主要由細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）、浸潤免疫細(xì)胞和脈管系統(tǒng)組成，通過多種尚未完全闡明的機(jī)制在驅(qū)動(dòng)腫瘤化學(xué)耐藥性方面起著至關(guān)重要的作用。CAFs 對(duì)作為胰腺導(dǎo)管腺癌一線用藥的吉西他濱具有天然抗性，其中涉及多種機(jī)制，例如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的抗凋亡/促存活通路、改變腫瘤吉西他濱的代謝和釋放外泌體等。

忽視腫瘤-基質(zhì)相互作用的次優(yōu)腫瘤建模（Suboptimal tumor modeling）被認(rèn)為是臨床前高藥物損耗率的重要因素。因此，迫切需要將基質(zhì)成分納入藥物篩選模型。PDAC腫瘤類器官近年來作為3D體外疾病模型出現(xiàn)，能夠保留原始腫瘤的內(nèi)在異質(zhì)性和遺傳改變。然而，基于純上皮類器官培養(yǎng)模型的藥物篩選未能考慮患者特異性腫瘤微環(huán)境的參與。因此，將相關(guān)基質(zhì)成分摻入類器官培養(yǎng)物是優(yōu)化腫瘤組織建模和藥物反應(yīng)預(yù)測的關(guān)鍵一步。

異細(xì)胞類器官培養(yǎng)有助于掌握CAF異質(zhì)性并剖析復(fù)雜的腫瘤-基質(zhì)相互作用。例如，使用小鼠類器官共培養(yǎng)系統(tǒng)鑒定出兩種不同但具有可塑性的CAF亞型，即myCAFs 和 iCAFs。Tsai團(tuán)隊(duì)建立了包括CAFs和T細(xì)胞在內(nèi)的PDAC類器官的培養(yǎng)，進(jìn)一步證明了這些模型適用于研究PDAC腫瘤微環(huán)境。然而，使用匹配的3D異型類器官培養(yǎng)物進(jìn)行個(gè)性化藥物篩選分析尚未報(bào)道。

2022年10月，來自德國海德堡大學(xué)醫(yī)院歐洲胰腺中心、柏林夏里特醫(yī)學(xué)院及奧地利維也納醫(yī)科大學(xué)普外科等團(tuán)隊(duì)在 Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 雜志發(fā)表了題為“Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system” 的文章。該研究建立了患者來源的PDAC類器官（PDOs）和患者匹配的CAFs的直接3D共培養(yǎng)模型，使用基于實(shí)時(shí)圖像的藥物測定DeathPro，探討了CAFs對(duì)一線化療藥物吉西他濱，5-氟尿嘧啶（5-FU）和紫杉醇的PDO化療敏感性的影響，并在單細(xì)胞水平上闡明了腫瘤-基質(zhì)相互作用誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化。
 

首先，建立了5對(duì)患者匹配的PDAC腫瘤類器官（PDAC-PDOs）和CAFs直接的3D共培養(yǎng)模型。證據(jù)表明，CAFs在3D培養(yǎng)模型中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，在5個(gè)匹配的共培養(yǎng)物中有4個(gè)觀察到CAFs對(duì)PDAC類器官增殖的增強(qiáng)作用。

接下來，在PDO單培養(yǎng)和PDO/CAF共培養(yǎng)中，評(píng)估PDOs對(duì)臨床治療中常用的三種化療藥物，即吉西他濱、5-FU和紫杉醇的敏感性。

通過DeathPro、Hoechst和propidium iodide染色等方法，實(shí)驗(yàn)觀察到響應(yīng)曲線的細(xì)胞死亡和增殖抑制參數(shù)的強(qiáng)相關(guān)性。在沒有藥物治療的對(duì)照條件下，CAFs對(duì)類器官增殖的增強(qiáng)作用導(dǎo)致共培養(yǎng)中類器官的相對(duì)生長比單培養(yǎng)平均增加1.3倍。對(duì)照條件下，類器官中細(xì)胞死亡的基礎(chǔ)水平在單培養(yǎng)和共培養(yǎng)之間沒有顯著差異。

吉西他濱、5-FU和紫杉醇處理誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡在PDO單培養(yǎng)中顯著高于PDO/CAF共培養(yǎng)（圖1 A、B）。在共培養(yǎng)條件下，平均死亡值顯著降低，表明CAFs的存在導(dǎo)致類器官對(duì)化療的細(xì)胞毒性作用的抗性增加。然而，這種影響的程度是患者和藥物特異性的，提示腫瘤-基質(zhì)相互作用對(duì)化療耐藥機(jī)制的影響存在異質(zhì)性。共培養(yǎng)中的PDOs也顯示出吉西他濱誘導(dǎo)的增殖抑制降低（圖1 C、D）。5-FU僅觀察到最大值顯著的下降。紫杉醇處理后，在CAFs存在下，類器官增殖抑制沒有顯著差異（圖 1 C、D）。值得注意的是，紫杉醇在抑制類器官增殖方面不如吉西他濱或5-FU（圖1 C）。

這些數(shù)據(jù)表明，CAFs對(duì)吉西他濱，5-FU和紫杉醇對(duì)PDAC-PDOs的細(xì)胞毒性作用具有保護(hù)效應(yīng)，直接促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞耐藥性，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了異型培養(yǎng)模型與個(gè)性化體外藥物檢測的相關(guān)性。

圖1   類器官與匹配的CAFs共培養(yǎng)時(shí)藥物敏感性降低。

（A、B）與CAFs共培養(yǎng)時(shí)，吉西他濱、5-FU和紫杉醇誘導(dǎo)的PDAC類器官的細(xì)胞死亡顯著降低。（C、D ）吉西他濱誘導(dǎo)的PDAC類器官中的增殖抑制在共培養(yǎng)中顯著降低（AUCpi, max. PI）。對(duì)于5-FU，max 明顯較低。在共培養(yǎng)中觀察PDAC類器官的PI（增殖抑制）。

然后，為了深入了解CAFs觸發(fā)的PDAC類器官化療耐藥性增加的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了scRNA-seq以鑒定PDO/CAF共培養(yǎng)中誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化，在3D單培養(yǎng)和共培養(yǎng)5天后對(duì)3株類器官和患者匹配的CAFs進(jìn)行單細(xì)胞測序（圖2 A）。類器官細(xì)胞通過腫瘤標(biāo)志物KRT18和KRT19的表達(dá)進(jìn)行鑒定，而CAFs通過DCN和LUM表達(dá)來鑒定（圖2 B）。實(shí)驗(yàn)觀察到，類器官和CAF群體的患者特異性聚類，表明單體樣本之間的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性（圖2 B）。

所有測序的CAFs聚類可以區(qū)分出7個(gè)轉(zhuǎn)錄簇（圖2 C、D），它們具有不同的功能特征。在共培養(yǎng)中，觀察到第5簇的CAFs的比例增加（圖2 E），其特征在于與細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)較高，表明共培養(yǎng)中CAFs的增殖可能增加。另一方面，與炎癥、運(yùn)動(dòng)和TNF-α信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的第1簇的比例在共培養(yǎng)中降低（圖2 E），盡管這僅限于單個(gè)樣本（112）水平的情況。然而，由于CAFs亞型之間的解離效率可能存在差異，這些數(shù)據(jù)的比例可能無法完全反映培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)量。

而且與單獨(dú)培養(yǎng)CAFs相比，共培養(yǎng)的CAFs集群也呈現(xiàn)差異化表達(dá)。在iCAF和myCAF兩種不同的轉(zhuǎn)錄簇分析中，88.5% 的CAF群體對(duì)應(yīng)于myCAFs（6509個(gè)細(xì)胞），而11.5% 被歸類為iCAFs（847個(gè)細(xì)胞）。iCAFs幾乎完全對(duì)應(yīng)于炎癥相關(guān)的簇1（圖2 F）。iCAF標(biāo)記基因在共培養(yǎng)環(huán)境中的表達(dá)水平高于單培養(yǎng)（圖2 G）。

通過對(duì)所有細(xì)胞簇中差異表達(dá)基因的基因集富集分析，進(jìn)一步比較了單培養(yǎng)和共培養(yǎng)中的CAFs。共培養(yǎng)中兩個(gè)顯著富集的基因集與增殖有關(guān)（圖2 H）。在共培養(yǎng)中富集最高的基因集中，發(fā)現(xiàn)了與炎癥相關(guān)的標(biāo)志性基因集（圖2 H、I）。

這些數(shù)據(jù)表明，與PDAC類器官共培養(yǎng)誘導(dǎo)CAFs中的促炎表型，這可能驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞中增強(qiáng)的化療耐藥性，并且可能提供治療分子靶點(diǎn)。

圖2   與PDAC類器官共培養(yǎng)后，CAFs中的炎癥途徑表達(dá)上調(diào)。

（A）用于單細(xì)胞RNA測序的樣本概述。（B）所有單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的 UMAP 表示。虛線表示CAF和PDAC細(xì)胞。（C）來自單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)樣本的CAFs的綜合UMAP表示，其中7個(gè)聚類。（D）C中每個(gè) CAF 簇的前五個(gè)富集基因的單細(xì)胞表達(dá)。（E）CAFs在單培養(yǎng)和共培養(yǎng)中7個(gè)簇中的分布。（F）iCAF樣和myCAF樣細(xì)胞的分布。（G）在F中鑒定的 iCAF 樣和 myCAF 樣群體中 iCAF 和 myCAF 標(biāo)記基因的表達(dá)，比較單培養(yǎng)（藍(lán)色）和共培養(yǎng)（紅色）。與單培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)中CAF中選定的Hallmark（H）和Reactome（R）通路上調(diào)。（I）在單培養(yǎng)（藍(lán)色）和共培養(yǎng)（紅色）中， CAF 中 TGFβ、IFN 和 TNFα 信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，顯示共培養(yǎng)條件下表達(dá)增加。

所有測序的PDAC-PDO細(xì)胞中鑒定了8個(gè)轉(zhuǎn)錄簇。每個(gè)簇的比例在類器官系之間不同，反映了患者特異性轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性。有趣的是，與單一培養(yǎng)相比，沒有觀察到共培養(yǎng)中PDAC類器官細(xì)胞的任何已鑒定轉(zhuǎn)錄簇的增殖評(píng)分有顯著變化。

最后，通過在單細(xì)胞水平上對(duì)每個(gè)亞型基因特征的表達(dá)進(jìn)行評(píng)分，進(jìn)一步根據(jù)PDAC中的兩種主要轉(zhuǎn)錄亞型（即經(jīng)典亞型和基底樣亞型）來表征PDO細(xì)胞。在單培養(yǎng)和共培養(yǎng)條件下未觀察到亞型評(píng)分的顯著差異，表明CAFs的存在不會(huì)在模型中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞亞型狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。

為了評(píng)估與CAFs共培養(yǎng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化，分析了PDAC類器官細(xì)胞在單培養(yǎng)和共培養(yǎng)條件下的差異表達(dá)基因。與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的幾個(gè)基因，如COL1A1，COL1A2，F(xiàn)N1，LAMC2和VIM在共培養(yǎng)的類器官細(xì)胞中上調(diào)。此外，還發(fā)現(xiàn)與炎癥相關(guān)的基因集在與CAFs共培養(yǎng)的類器官細(xì)胞中富集。

進(jìn)一步關(guān)注已鑒定的PDAC細(xì)胞轉(zhuǎn)錄簇的EMT標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)在共培養(yǎng)條件下幾乎所有簇的EMT表達(dá)評(píng)分都有所增加。幾個(gè)單獨(dú)的EMT相關(guān)基因的表達(dá)在共培養(yǎng)中也上調(diào)。通過結(jié)合Cell Phone DB（配體-受體相互作用的開放庫），檢測到PDO細(xì)胞（受體）和CAFs（配體）之間潛在的細(xì)胞間受體-配體相互作用。此外，在PDAC類器官細(xì)胞和CAFs之間鑒定出與EMT相關(guān)的幾種受體-配體相互作用，如CD44-HGF，CD44-LGALS9或CD44-FGF2。通過免疫熒光染色，可以在原始組織中確認(rèn)受體-配體相互作用對(duì)CD44-HGF的空間接近和共定位，支持了共培養(yǎng)模型中發(fā)生的腫瘤-基質(zhì)相互作用的體內(nèi)相關(guān)性。

這些數(shù)據(jù)表明，CAFs和上皮癌細(xì)胞之間的細(xì)胞間相互作用在共培養(yǎng)系統(tǒng)中得以復(fù)制，導(dǎo)致PDAC類器官細(xì)胞中EMT的上調(diào)和化學(xué)抗性增加。

總之，該研究表明，PDAC類器官在與患者匹配的CAFs共培養(yǎng)中的化療耐藥性增加，強(qiáng)調(diào)了復(fù)雜共培養(yǎng)模型與個(gè)性化醫(yī)療應(yīng)用的相關(guān)性。這也為以患者特異性方式研究靶向腫瘤微環(huán)境的藥物的功效和作用方式提供了可能性。因此，這項(xiàng)研究為在高通量可接受的3D培養(yǎng)環(huán)境中模擬患者特異性腫瘤-基質(zhì)相互作用以進(jìn)行相關(guān)發(fā)現(xiàn)和藥物測試提供了可行性的證據(jù)。

參考文獻(xiàn)：Schuth S, Le Blanc S, Krieger TG, Jabs J, Schenk M, Giese NA, Büchler MW, Eils R, Conrad C, Strobel O. Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Oct 22;41(1):312. doi: 10.1186/s13046-022-02519-7. PMID: 36273171; PMCID: PMC9588250.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36273171/

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