腫瘤干細胞的分離與鑒定
腫瘤干細胞對腫瘤的存活、增殖、轉移及復發(fā)有著重要作用。從本質上講，腫瘤干細胞通過自我更新和無限增殖維持著腫瘤細胞群的生命力。
一、腫瘤干細胞的特性
1、具有無限增殖和分化潛能
腫瘤的發(fā)生是一個長期的突變積累過程，在皮膚及腸黏膜上皮等腫瘤的高發(fā)部位，衰老細胞不斷地死去并脫離機體，只有干細胞是唯一可以長期存在的細胞，有可能積累多次突變而生成腫瘤干細胞，進而最終形成腫瘤。
2、比例小
腫瘤干細胞主要通過兩種方式分裂：
一種是對稱分裂，即形成兩個相同的腫瘤干細胞或兩個相同的分化腫瘤細胞；
另一種是非對稱分裂，即腫瘤干細胞分裂后形成的兩個細胞中有一個細胞不可逆地走向分化的終端成為功能專一的分化腫瘤細胞，而另一個保持親代的特征，仍作為腫瘤干細胞保留下來。由于這種類似于干細胞的分裂方式，低密度的腫瘤干細胞能在維持自身數量的同時產生出分化的腫瘤細胞。
3. 具有高端粒酶活性
高活性的端粒酶可抑制細胞增殖過程中端粒長度的縮短，延長腫瘤干細胞的增殖壽命，這為腫瘤干細胞的不斷增殖和分化提供了基礎條件。
4. 抗凋亡家族蛋白過表達
研究發(fā)現，大部分腫瘤干細胞中抗凋亡基因 Bcl- 2 的表達量顯著增加，從而啟動腫瘤干細胞內抗凋亡程序，阻斷 Bid 和 Bad 等促凋亡蛋白引起的線粒體凋亡途徑，并進一步阻斷胱天蛋白酶凋亡途徑，防止腫瘤干細胞發(fā)生凋亡。
5. DNA 修復能力顯著增強
研究發(fā)現，腫瘤干細胞內與 DNA 損傷修復相關的核酸內切酶、DNA 聚合酶和 DNA 連接酶等酶蛋白的合成增加、活性增強，增強了腫瘤干細胞的抗 DNA 損傷能力，使得腫瘤干細胞可逃避以 DNA 損傷為主的腫瘤治療手段。
6. 長時間處于 G0 期
臨床上普遍使用的化療藥物主要是針對增殖旺盛的腫瘤細胞進行殺傷，處在 G0 期的大多數腫瘤干細胞能逃避傳統(tǒng)腫瘤治療方法的殺傷，一旦時機成熟或停止用藥，它們便成為復發(fā)的根源。
7. 處于低氧環(huán)境中
腫瘤干細胞通常位于由發(fā)育良好的三維細胞外基質包裹的低氧環(huán)境中，這些細胞外基質起到很好的屏障作用，盡可能避免了腫瘤干細胞接觸到抗腫瘤藥物。同時由于射線引起的 DNA 損傷需要氧氣，所以腫瘤干細胞所處的低氧環(huán)境使得放療對腫瘤干細胞的殺傷作用也非常局限舊。
8. 表達干細胞特異標志物
這些特異性蛋白或標志物在腫瘤干細胞的增殖、腫瘤干細胞分化成腫瘤組織周圍所必須的血管等組織、腫瘤干細胞的遷移等過程中發(fā)揮至關重要的作用。利用這些特異性的表面標志物達到腫瘤干細胞分離或鑒定的目的。
二、腫瘤干細胞分離
1. 免疫磁珠分選（MACS）
MACS 是基于腫瘤干細胞表面特異性抗原能與連接有磁珠的特異性單克隆抗體相結合，之后在外部磁場的作用下，連接有單克隆抗體磁珠的腫瘤干細胞停留在磁場中，而無特異性表面抗原的腫瘤細胞則不能與免疫磁珠結合，因而不能在磁場中停留，從而得以分離出腫瘤干細胞。
2. 流式細胞分選（FACS）
FACS 是通過將待分選的腫瘤細胞和腫瘤干細胞用同一種或多種熒光素標記的特異性抗體標記，根據腫瘤干細胞與腫瘤細胞結合熒光素標記抗體能力的差異，通過流式細胞儀將腫瘤干細胞分選出來的方法。
3. 根據生物學特性分離
根據腫瘤干細胞具有的某些生物學特性將腫瘤干細胞分離篩選出的方法。如可以通過細胞核對核染料的拒染性質、腫瘤干細胞體外培養(yǎng)所需的特殊條件等特性，分離出腫瘤干細胞。
4. 旁群細胞分選法 (SP)
腫瘤干細胞具有對核染料 Hoechst 33342 拒染的特性。Hoechst 33342 是一種核酸染料，在紫外光激發(fā)下可發(fā)出藍色熒光 (波長 450 nm 左右) 和紅色熒光 (波長 650 nm 左右)，腫瘤干細胞可將染料外排，而不發(fā)出熒光，從而可將這類旁群細胞分離出來。
5. 無血清培養(yǎng)基分選法 (SFM)
在合成培養(yǎng)基的基礎上，引入特定的生 長因子和細胞添加劑，使絕大多數腫瘤細胞由于缺乏生長所必須的血清成分而停止生長。
經長時間培養(yǎng)后最終死亡，而腫瘤干細胞則可以在含特定生長因子和添加劑的無血清培養(yǎng)基中呈球狀懸浮生長。
經幾代的培養(yǎng)增殖形成富含腫瘤于細胞的腫瘤細胞球在合成培養(yǎng)基的基礎上，引入特定的生長因子和細胞添加劑，使絕大多數腫瘤細胞由于缺乏生長所必須的血清成分而停止生長。
經長時間培養(yǎng)后最終死亡，而腫瘤干細胞則可以在含特定生長因子和添加劑的無血清培養(yǎng)基中呈球狀懸浮生長，經幾代的培養(yǎng)增殖形成富含腫瘤于細胞的腫瘤細胞球。
6. 聯合多種方法分離
在目前的研究中，腫瘤干細胞的分離并不是采用單一的方法，而是選用兩種或者兩種以上的分離方法，以獲得數量更多、純度更高的腫瘤干細胞。
三、腫瘤干細胞鑒定
1. 利用腫瘤干細胞特異性表面標志物進行鑒定
目前，腫瘤干細胞最為廣泛且可靠的鑒定方法就是利用腫瘤干細胞特異性表面標志物。將分離出的腫瘤干細胞通過免疫組織化學法、流式細胞檢測技術等方法測定陽性或陰性細胞表面標志物表達情況，進而鑒定是否是腫瘤干細胞。
2.異種移植成瘤性實驗鑒定
將分離出的腫瘤于細胞，制備成細胞懸液后種植到異種動物體內，如將人的腫瘤干細胞接種于 NOD/SCID 小鼠體內，觀察其能否形成腫瘤病灶，且異種動物體內形成的腫瘤病灶在組織學結構上與原發(fā)腫瘤病灶類似，則可鑒定為腫瘤干細胞。一般來說，腫瘤干細胞形成腫瘤病灶所需的細胞密度比普通腫瘤細胞要小。
3. 腫瘤干細胞的其他鑒定方法
對于腫瘤干細胞的鑒定，還可通過腫瘤干細胞具有的類干細胞特性進行鑒定。
如根據腫瘤干細胞核對核染料拒染 (如 Hoechst 33342 染料) 的性質進行鑒定；
根據腫瘤干細胞長期處于靜止狀態(tài)的特性，應用溴脫氧尿嘧啶核苷法進行鑒定和軟瓊脂克隆形成實驗鑒定等。
四、細胞成瘤性質控-端粒酶活性檢測方法
端粒酶催化亞基TERE表達量檢測試劑盒（QPCR法）
產品說明：端粒酶 (Telomerase ) 是一種酶促核糖核蛋白復合物。其催化亞基 (TERT) 具有逆轉錄酶的特性，TERT被認為是端粒酶活性表達的關鍵組分，其編碼的mRNA水平與端粒酶活性一致，與端粒酶的活化程度密切相關。因此，對端粒酶催化亞基的檢測可以間接反映樣本中端粒酶活性。
本產品試劑盒采用雙色熒光qPCR (TaqMan探針法) 檢測端粒酶催化亞基TERT基因和內參基因GAPDH 。通過提取細胞RNA ，利用特異性逆轉錄引物進行逆轉錄反應， 以cDNA為模板在單管中利用多重熒光定量PCR進行擴增反應 (雙重探針：FAM 、Cy5) 。選用293T細胞為陽性對照以及MRC-5細胞為陰性對照，判斷樣本中是否有TERT基因表達。該試劑盒具有以下特點：
1. 靈敏：雙色探針，靈敏度高。
2. 穩(wěn)定：全程閉管操作，無交叉污染。
3. 可靠：含內參基因，避免假陰性。
4. 方便：操作簡單，無需電泳步驟。
5. 定量： 以CT值判斷，可定量檢測。
