客戶案例 ：黏膜乳桿菌衍生的胞外囊泡調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型維持腸道穩(wěn)態(tài)

腹瀉疾病除在兒童和幼小動(dòng)物上有著極高的死亡率外，還造成機(jī)體腸道屏障功能受損繼而引發(fā)腸道炎癥，最終導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩。腸道菌群與腹瀉疾病密切相關(guān)，一些特定的細(xì)菌菌株已被證明具有抗腹瀉作用，然而其抗腹瀉機(jī)制尚未闡明。

2023年6月6日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陶詩(shī)煜副研究員團(tuán)隊(duì)在npj Biofilms and Microbiomes（IF=9.2）發(fā)表題為“Limosilactobacillus mucosae-derived extracellular vesicles modulates macrophage phenotype and orchestrates gut homeostasis in a diarrheal piglet model”的研究論文。該團(tuán)隊(duì)以新生仔豬、無(wú)菌(GF)小鼠和無(wú)特定病原體(SPF)小鼠為動(dòng)物模型，結(jié)合多組學(xué)、糞便微生物移植(FMT)、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88 (ETEC K88)誘導(dǎo)的腸道炎癥損傷模型以及黏膜乳桿菌(L. mucosae)及其衍生的胞外囊泡(EVs)的干預(yù)技術(shù)，系統(tǒng)地研究了新生腹瀉仔豬腸道菌群特征，揭示了腸道菌群與腹瀉疾病之間的關(guān)系，闡明了健康仔豬糞便來(lái)源的乳桿菌抗腹瀉的潛在機(jī)制。（麥特繪譜提供Q300全定量代謝組檢測(cè)分析服務(wù)）

本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖1. 本研究試驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究結(jié)果

1. 健康仔豬和腹瀉仔豬腸道菌群存在差異

本研究首先收集了新生健康仔豬和腹瀉仔豬的糞便樣品各30例進(jìn)行宏基因組測(cè)序。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)腹瀉和健康仔豬的微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)之間存在著巨大的差異，腹瀉仔豬腸道微生物的物種多樣性升高但豐富度降低。兩組仔豬的腸道微生物在種水平上存在巨大差異，其中有四個(gè)乳桿菌種顯著富集于健康仔豬組。隨機(jī)森林分析表明，羅伊式乳桿菌(L. reuteri)和黏膜乳桿菌(L. mucosae)是區(qū)分健康仔豬和腹瀉仔豬的關(guān)鍵菌種，提示它們可能在對(duì)抗腹瀉疾病中起著重要的介導(dǎo)作用。KEGG功能分析顯示，新生腹瀉仔豬的LPS生物合成通路顯著高于健康仔豬且糞便中的LPS含量也明顯高于健康仔豬。

圖2. 新生腹瀉仔豬與健康仔豬種水平腸道菌群特征

2. 腹瀉仔豬糞便菌群移植導(dǎo)致GF小鼠生長(zhǎng)遲緩、全身炎癥和腸道炎癥損傷

本研究將新生仔豬的糞便微生物群移植到GF小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植腹瀉仔豬糞便微生物群的GF小鼠生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，并伴有嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)。與供體結(jié)果一致，健康仔豬和腹瀉仔豬微生物受體GF小鼠之間的腸道微生物群區(qū)系結(jié)構(gòu)也存在明顯差異。值得注意的是，一些腸道微生物群相關(guān)的功能途徑從供體豬轉(zhuǎn)移到受體小鼠身上，如LPS的生物合成。另外腹瀉仔豬微生物受體小鼠血清中的LPS濃度顯著高于健康仔豬微生物受體小鼠的濃度。代謝組學(xué)結(jié)果顯示，兩組受體小鼠的糞便代謝物存在顯著差異。一些具有抗炎作用的代謝物(3,4-二羥基苯丙酸、高香草酸和苯乳酸在健康仔豬微生物受體小鼠中富集，而促炎代謝物(吡啶甲酸)則在腹瀉仔豬微生物受體小鼠中富集。

圖3. H-FMT GF小鼠與D-FMT GF小鼠的生長(zhǎng)、全身炎癥和腸道轉(zhuǎn)錄組特征的評(píng)估

另外，腹瀉仔豬腸道微生物群移植后對(duì)受體GF小鼠腸道發(fā)育也有巨大影響，具體表現(xiàn)為各腸段組織的基因表達(dá)譜發(fā)生顯著變化。RNA-seq結(jié)果顯示，5個(gè)腸段的差異基因主要富集在與炎癥和免疫相關(guān)的信號(hào)通路上，如NF-κB和PI3K-AKT。NFκB和AKT是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要蛋白分子，磷酸化后激活其生物學(xué)功能。WB結(jié)果顯示，NF-κB和AKT的磷酸化在腹瀉受體小鼠的腸道中均升高，而緊密連接蛋白表達(dá)水平降低。同時(shí)促炎細(xì)胞因子水平在腹瀉仔豬微生物受體小鼠腸道組織中也同樣升高。以上結(jié)果表明，腹瀉個(gè)體腸道菌群紊亂通過(guò)激活炎癥信號(hào)通路，損害腸道屏障功能，引發(fā)機(jī)體腸道炎癥反應(yīng)。

圖4. H-FMT GF小鼠與D-FMT GF小鼠的腸道屏障、炎癥反應(yīng)和微環(huán)境特征

3. L. mucosae通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)腸道菌群緩解GF受體小鼠腹瀉癥狀

上述宏基因組結(jié)果提示L. reuteri和L. mucosae是區(qū)分健康和腹瀉新生仔豬的關(guān)鍵菌種。為了驗(yàn)證它們是否具有潛在的抗腹瀉功效，研究團(tuán)隊(duì)從健康新生仔豬糞便樣本中分離出L. reuteri和L. mucosae菌株后進(jìn)行后續(xù)干預(yù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，只有L. mucosae能夠顯著緩解由腹瀉仔豬糞便微生物群所致的GF小鼠生長(zhǎng)遲緩和腸道炎癥損傷。16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)L. mucosae干預(yù)后腹瀉仔豬微生物受體小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，乳酸菌屬在L. mucosae干預(yù)組顯著富集。

圖5. L. reuteri和L. mucosae對(duì)腹瀉仔豬糞便菌群所致腸道損傷的緩解作用

4. L. mucosae通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)腸道菌群緩解ETEC K88攻毒小鼠腹瀉癥狀

本研究還探討了L. mucosae對(duì)ETEC K88攻毒SPF小鼠后的影響。數(shù)據(jù)顯示L. mucosae通過(guò)抑制LPS的合成、NF-κB和AKT的磷酸化表達(dá)及增加乳酸菌豐度，有效緩解由ETEC K88攻毒引起的炎癥反應(yīng)和腸道損傷。

圖6. L. mucosae對(duì)ETEC K88攻毒小鼠腸道損傷的緩解作用

5. L. mucosae衍生的EVs (LmEVs)介導(dǎo)巨噬細(xì)胞分型緩解ETEC K88攻毒小鼠腹瀉癥狀

微生物對(duì)宿主生理功能的調(diào)節(jié)除了與宿主直接相互作用外，還可以通過(guò)分泌活性物質(zhì)來(lái)介導(dǎo)。細(xì)菌分泌的胞外囊泡可以通過(guò)運(yùn)輸和遞送調(diào)節(jié)宿主信號(hào)通路和細(xì)胞過(guò)程的效應(yīng)分子來(lái)影響宿主的健康。本研究成功分離并鑒定了LmEVs進(jìn)行后續(xù)的干預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LmEVs能夠緩解腹瀉癥狀且比親本細(xì)菌更佳。

圖7. LmEVs對(duì)ETEC K88攻毒小鼠腸道損傷的緩解作用

6. 巨噬細(xì)胞是LmEVs緩解ETEC K88攻毒小鼠腹瀉癥狀所必需的

巨噬細(xì)胞作為啟動(dòng)和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的核心細(xì)胞，可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)上皮屏障的完整性，在維持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，LmEVs干預(yù)能激活M2巨噬細(xì)胞極化，抑制炎癥調(diào)節(jié)蛋白(NF-κB和AKT)的表達(dá)。然而，在巨噬細(xì)胞消除小鼠模型中，LmEVs喪失了緩解腹瀉癥狀的能力。以上結(jié)果表明，LmEVs通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型緩解腹瀉癥狀。

圖8. 巨噬細(xì)胞清除對(duì)LmEVs在緩解ETEC k88攻毒小鼠腸道損傷中的影響

小結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬中腸道菌群紊亂，主要特征是乳酸菌豐度降低、大腸桿菌豐度增加和LPS生物合成通路增加，其中L. mucosae和L. reuteri是區(qū)分仔豬健康和腹瀉的關(guān)鍵細(xì)菌；腹瀉仔豬微生物群移植GF小鼠后導(dǎo)致其生長(zhǎng)遲緩、腸道炎癥損傷、腸道菌群及代謝紊亂；機(jī)制上，腹瀉個(gè)體的腸道菌群通過(guò)激活LPS促炎信號(hào)通路，導(dǎo)致腸道屏障功能受損，過(guò)量的LPS從腸腔轉(zhuǎn)移到血液循環(huán)中，誘發(fā)全身性的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩；從健康仔豬糞便中分離的L. mucosae可緩解小鼠腹瀉癥狀；L. mucosae衍生的EVs調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型緩解ETEC K88攻毒小鼠的腹瀉癥狀。

圖9. 本研究結(jié)果總結(jié)圖

原文文獻(xiàn)

Li, J., Feng, S., Wang, Z. et al. Limosilactobacillus mucosae-derived extracellular vesicles modulates macrophage phenotype and orchestrates gut homeostasis in a diarrheal piglet model. npj Biofilms Microbiomes 9, 33 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00403-6

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供稿：陶詩(shī)煜副研究員團(tuán)隊(duì)

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