細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室方法及流程

內(nèi)容大綱
細(xì)胞培養(yǎng)與廢液抽吸
細(xì)胞培養(yǎng)流程
廢液抽吸方法的比較法 
細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)備
廢液處理與廢棄辦法

然而，細(xì)胞生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生代謝物、細(xì)胞碎片等廢棄物影響細(xì)胞健康，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡 。因此在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，需定期更換培養(yǎng)液，而移除舊有培養(yǎng)液、洗滌液的行為，則為廢液抽吸。

真空廢液抽吸裝置 (suction system, aspiration system) 常見如上圖，主要包含：

A. 真空瓶 (vacuum flask)
B. 緩沖瓶 (safety bottle)
C. 過濾器 (filter) 
D. 真空源 (vacuum source)

連接并啟動(dòng)真空源后，細(xì)胞培養(yǎng)瓶/皿中的廢液會(huì)因壓力差而被抽吸、收集至真空瓶，緩沖瓶則做為防溢裝置使用，以避免廢液被抽吸至真空源內(nèi)。過濾器可使用HEPA濾膜(High Efficiency Particulate Air filter 或 0.22 µm過濾器，以過濾掉廢液及空氣中的粒子、確保抽吸效率。

細(xì)胞培養(yǎng)前，請(qǐng)確認(rèn)操作環(huán)境符合無菌操作條件，且應(yīng)避免和細(xì)菌實(shí)驗(yàn)共享設(shè)備，以防污染。

1. 解凍細(xì)胞 (thawing cells)：將冷凍細(xì)胞以 37 oC 快速解凍、回溫，以避免細(xì)胞損傷。

2. 培養(yǎng) (cell culture)：依據(jù)細(xì)胞種類和濃度，將細(xì)胞和培養(yǎng)基均勻混合后，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3. 繼代培養(yǎng) (cell subculture)：當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至一定程度后，收集細(xì)胞，分殖于新的培養(yǎng)基中。

進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，其依細(xì)胞種類不同，處理方式可分為以下兩大類：

a. 附著型細(xì)胞 (adherent cell)，又稱貼壁培養(yǎng)、單層培養(yǎng) (monolayer culture)

· 去除舊培養(yǎng)基廢液

· 以 Phosphate buffered saline (PBS) 洗滌細(xì)胞一至二次

· 加入 trypsin-EDTA溶液，于 37 oC 下作用 2~20 分鐘，使細(xì)胞可自培養(yǎng)瓶/皿中脫落

· 加入含有血清的新鮮培養(yǎng)基中，以終止胰蛋白酶作用

· 將脫落的細(xì)胞及其團(tuán)塊打散、混合均勻后，收集所有液體

· 離心后移除上清液，并添加新鮮培養(yǎng)基，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶/皿中進(jìn)行培養(yǎng)

b. 懸浮型細(xì)胞 (suspension cell)，又稱懸浮培養(yǎng) (suspension culture)

· 將細(xì)胞培養(yǎng)液以 1000 rpm 離心 5 分鐘后，吸除上清液

· 加入適量新鮮培養(yǎng)基，與沉淀細(xì)胞混合均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶/皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

4. 冷凍細(xì)胞 (cryopreservation)：獲得目標(biāo)細(xì)胞株后，將細(xì)胞懸浮于含有 5~10 % DMSO (二甲基亞砜，dimethyl sulfoxide) 及 30~50% FBS (胎牛血清，Fetal Bovine Serum) 的新鮮培養(yǎng)液中，以 -80 oC 或液態(tài)氮等低溫設(shè)備保存。

5. 細(xì)胞計(jì)數(shù) (cell counting)：用以計(jì)算細(xì)胞濃度，可利用傳統(tǒng)血球計(jì)數(shù)器 (Neubauer chamber) 或自動(dòng)計(jì)數(shù)器 ，計(jì)算細(xì)胞濃度可用來判斷目前細(xì)胞生長(zhǎng)的情況。

廢液抽吸目前有多種方法可以進(jìn)行。 早期實(shí)驗(yàn)室多利用移液器(pipette)或電動(dòng)吸管抽吸廢液，然而因?yàn)樾枰�重覆抽吸及排除液體，長(zhǎng)時(shí)間使用下來易造成手部不適及疲勞。除此之外，電動(dòng)吸管須搭配無菌刻度吸管使用，而現(xiàn)多使用拋棄式吸管排除污染疑慮，因此一次實(shí)驗(yàn)下來通常會(huì)產(chǎn)生大量廢棄物，造成環(huán)境負(fù)擔(dān)。
現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室則普遍會(huì)自行購(gòu)置真空幫浦搭配真空瓶自行組裝，如此會(huì)較電動(dòng)吸管有效率，且設(shè)備取得較容易，然而自組式系統(tǒng)常見許多例如：管線配置不良，造成工作環(huán)境混亂、或是玻璃吸管經(jīng)常破裂等安全性上的缺點(diǎn)。

Lafil 廢液抽吸系統(tǒng)及 BioDolphin 廢液抽吸套件主要為生命科學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)過程中溶液抽吸應(yīng)用，可直接放置于無菌無塵操作臺(tái) (laminar flow) 使用。Lafil 廢液抽吸系統(tǒng)整合真空源、真空瓶與廢液抽吸套件，提供實(shí)驗(yàn)室一體化解決方案，更比傳統(tǒng)廢液抽吸系統(tǒng)減少一半臺(tái)面占用面積，并使用圍籬式平臺(tái)固定真空瓶，避免操作者不小心碰觸瓶身而傾倒。
洛科Lafil 廢液抽吸系統(tǒng)及 BioDolphin 廢液抽吸套件

廢液處理與廢棄辦法

含有危險(xiǎn)化學(xué)品（如氯）之有機(jī)廢液應(yīng)收集至設(shè)有適當(dāng)標(biāo)示之專用廢液桶，不含危險(xiǎn)化學(xué)品之其它廢液可一并收集于一般混合廢液桶，廢油則需收集于廢油桶中。細(xì)胞培養(yǎng)用的廢液應(yīng)加入適當(dāng)濃度的消毒劑，如漂白水(次氯酸鈉Sodium Hypochlorite)，使細(xì)胞致死，再倒入水槽或廢液桶。培養(yǎng)皿等生物醫(yī)療相關(guān)廢棄物則應(yīng)置于生物醫(yī)療廢棄物袋中，進(jìn)行高溫高壓滅菌后以一般廢棄物丟棄，或是請(qǐng)依照我國(guó)生物醫(yī)療廢棄物相關(guān)規(guī)定處理。