分子克隆技術(shù)的研究應(yīng)用領(lǐng)域及實驗步驟
一、概念
分子克隆技術(shù)是一種在分子水平上操作的技術(shù)，用于將特定的DNA片段從供體生物中分離出來，然后通過體外重組、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等方法，將其插入到適合的克隆載體中，并將重組克隆載體引入到合適的寄主體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增。最終通過篩選、分離出所需的目的克隆載體，得到多拷貝的目的DNA，從而實現(xiàn)目的基因的擴(kuò)增。
二、涉及研究領(lǐng)域
1. 分子克隆技術(shù)為許多研究領(lǐng)域提供了重要的方法和手段，以下是一些主要的研究領(lǐng)域：
①基因克隆和表達(dá)：分子克隆技術(shù)可以用于從供體生物中分離特定的DNA片段，然后將其插入到克隆載體中以實現(xiàn)目的基因的擴(kuò)增和表達(dá)。這一技術(shù)對于研究和理解基因的功能以及開發(fā)新的基因療法和藥物至關(guān)重要。例如，可以研究基因表達(dá)產(chǎn)物的相互作用、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能等。
②病毒包裝和基因治療：通過分子克隆技術(shù)，科學(xué)家們可以創(chuàng)建含有特定病毒基因的重組載體，然后將其導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中以產(chǎn)生病毒顆粒。這種技術(shù)被廣泛應(yīng)用于疫苗開發(fā)和基因治療。
③細(xì)胞治療和基因修飾：通過使用分子克隆技術(shù)，科學(xué)家們可以修改和修飾細(xì)胞基因組，從而改變細(xì)胞的特性和功能。這種技術(shù)對于研究疾病機(jī)制、開發(fā)新的細(xì)胞療法以及生產(chǎn)具有特定功能的細(xì)胞系具有重要的應(yīng)用價值。例如，通過CRISPR-Cas9等技術(shù)可以實現(xiàn)定點敲除、插入或替換特定基因；或者可以構(gòu)建CAR-T細(xì)胞治療腫瘤、干細(xì)胞治療脊髓損傷等。
④蛋白質(zhì)組學(xué)和生物大分子研究：分子克隆技術(shù)可用于創(chuàng)建含有特定蛋白質(zhì)或生物大分子編碼基因的重組載體，然后在宿主細(xì)胞中表達(dá)和純化這些蛋白質(zhì)或生物大分子。這種技術(shù)對于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能以及開發(fā)新的藥物和療法具有重要意義。
⑤基因敲除和功能研究：通過使用分子克隆技術(shù)，可以創(chuàng)建含有特定基因敲除序列的重組載體，然后將它們導(dǎo)入到細(xì)胞中以刪除目標(biāo)基因。這種技術(shù)被廣泛應(yīng)用于研究基因的功能和確定特定基因在細(xì)胞生物學(xué)中的作用。例如，通過敲除小鼠或其他模式生物中的特定基因，可以研究該基因?qū)ιL發(fā)育、代謝等方面的作用。
⑥藥物篩選和研究：利用分子克隆技術(shù)可以構(gòu)建藥物篩選模型，快速篩選出具有特定作用機(jī)制的藥物。例如，可以構(gòu)建突變體細(xì)胞系或模式生物，研究藥物的作用機(jī)制和效果。
⑦農(nóng)業(yè)和動物育種：分子克隆技術(shù)可以用于培育轉(zhuǎn)基因作物和動物，提高產(chǎn)量、抗性以及生產(chǎn)高質(zhì)量的農(nóng)產(chǎn)品。此外，分子克隆技術(shù)還可以應(yīng)用于動物育種，實現(xiàn)優(yōu)良性狀的基因組合。
2.應(yīng)用舉例說明
舉例一：研究人類基因功能。若想要研究某個人類基因在細(xì)胞中的功能，可以使用分子克隆技術(shù)克隆該基因，并將其插入細(xì)胞中，觀察基因表達(dá)對細(xì)胞功能的影響，從而揭示該基因的功能。
舉例二：制備重組蛋白。若需要大量的特定蛋白用于實驗或藥物研發(fā)，可以使用分子克隆技術(shù)將目標(biāo)蛋白的基因插入表達(dá)載體中，然后在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)目標(biāo)蛋白，并進(jìn)行后續(xù)的純化和功能研究。
舉例三：改良作物品質(zhì)。若想要改良某個作物的品質(zhì)，可以使用分子克隆技術(shù)克隆與目標(biāo)性狀相關(guān)的基因，并將其插入作物基因組中，從而實現(xiàn)對作物品質(zhì)的改良，例如提高作物的抗病性、產(chǎn)量和品質(zhì)。
總結(jié)起來，分子克隆技術(shù)是一項重要的分子生物學(xué)技術(shù)，通過重組DNA分子，可以制備大量相同的DNA片段。它在基因研究、蛋白表達(dá)、基因治療、農(nóng)業(yè)改良和藥物研發(fā)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
三、實驗步驟
1.獲取目的基因片段：
①樣本采樣保存：為保證提取出的核酸質(zhì)量優(yōu)質(zhì)且穩(wěn)定，采樣后應(yīng)及時處理及妥善保存，以便于后續(xù)實驗的成功。
②核酸提取
核酸提取是在分子生物學(xué)實驗中從細(xì)胞或生物組織中分離并純化核酸的過程。
以下是一些常見的核酸提取方法：
☆ 酚/氯仿抽提法：通過酚/氯仿處理細(xì)胞破碎液或組織勻漿后，在水相中主要溶解的是以DNA為主的核酸成分，在有機(jī)相中主要是脂類物質(zhì)，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含核酸的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀核酸，之后再離心分離和純化溶解即可得到高純度核酸。該法最大優(yōu)勢是成本低，對實驗條件要求較低，提取的核酸保持天然狀態(tài)，獲得的核酸純度高、片段大、效果好。缺點是操作較為繁瑣。
☆ 煮沸裂解法：適用于提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA。但得量少，雜質(zhì)多，DNA可能會出現(xiàn)斷裂，主要適用于一些粗略的實驗。
☆ 堿裂解法：適用于提取質(zhì)粒DNA。這種方法是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們的。
☆ 層析柱法：通過特殊硅基質(zhì)吸附材料，能夠特定吸附DNA，而RNA和蛋白質(zhì)順利通過，然后利用高鹽低PH結(jié)合核酸，低鹽高PH值洗脫，來分離純化核酸。
☆ 熱裂解堿法：堿法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離他們，在堿性下，變性蛋白是可溶的。
☆ 乙醇沉淀法：乙醇能夠消除核酸的水化層，使帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)暴露出來，Na+等帶正電荷離子能與磷酸基團(tuán)結(jié)合，形成沉淀。
☆ 核酸提取儀：應(yīng)用配套的核酸提取試劑來自動完成樣本核酸提取工作的儀器。
以上方法僅供參考，實際操作中請依據(jù)具體情況選擇。
③逆轉(zhuǎn)錄（此步驟僅限于提取的核酸為RNA時使用）
④PCR
以上內(nèi)容請參考：分子技術(shù)#1、2、3、4
⑤凝膠電泳實驗
☆ 實驗需要準(zhǔn)備材料：瓊脂糖、緩沖液、DNA樣品、DNA Marker、Loading buffer、核酸染料、核酸預(yù)制膠（若不自己配膠，可直接購買成品的預(yù)制膠）
☆ 實驗設(shè)備：燒杯、量筒、天平、加熱設(shè)備、電泳儀、電泳槽、制膠設(shè)備、移液器、吸頭、凝膠成像系統(tǒng)、電腦
☆實驗步驟
看凝膠電泳實驗的實驗視頻
2.載體的選擇
在分子克隆中，載體選擇是非常關(guān)鍵的一步，因為它的性質(zhì)和種類將直接影響實驗的效率和結(jié)果。根據(jù)載體的性質(zhì)和功能，可以將其分為以下幾類：
按進(jìn)入受體細(xì)胞的類型分類：
原核載體：原核細(xì)胞（如大腸桿菌）可直接攝取并表達(dá)重組體中的外源基因，因此原核載體常被用于原核細(xì)胞克隆。
真核載體：真核細(xì)胞（如酵母、哺乳動物細(xì)胞等）不能直接攝取重組體中的外源基因，但可以通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等方法將重組體導(dǎo)入細(xì)胞中并表達(dá)外源基因，因此真核載體常被用于真核細(xì)胞克隆。
穿梭載體：穿梭載體既含有原核復(fù)制子，又含有真核復(fù)制子，可以在原核和真核兩種宿主細(xì)胞中復(fù)制，并在真核細(xì)胞中有效表達(dá)。
按功能分類：
克隆載體：主要用于DNA克隆和擴(kuò)增。它是一種可以接受外源DNA插入的DNA分子，通常包括質(zhì)粒、噬菌體、宇宙中介病毒（Cosmid）等。例如，pUC19就是一種常用的質(zhì)粒型克隆載體。通過將外源DNA插入到克隆載體中，然后在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增，可以獲得大量的目標(biāo)DNA分子。這在基因組學(xué)、基因克隆、DNA測序等方面的研究中具有重要作用。
表達(dá)載體：其更復(fù)雜，它不僅可以攜帶并復(fù)制外源基因的功能，還具有在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白的功能。表達(dá)載體通常包含啟動子和終止子等具有調(diào)控基因表達(dá)功能的序列。例如，pET系列表達(dá)載體可以在大腸桿菌中表達(dá)插入的外源基因，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)主要用于研究蛋白的功能、結(jié)構(gòu)和相互作用等。表達(dá)載體的應(yīng)用主要集中在基因表達(dá)調(diào)控研究、蛋白質(zhì)相互作用研究、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析、基因治療等領(lǐng)域。
總的來說，克隆載體和表達(dá)載體的主要區(qū)別在于：克隆載體主要用于獲取大量目標(biāo)DNA分子，而表達(dá)載體則主要用于在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目標(biāo)基因及其對應(yīng)的蛋白質(zhì)。這兩種載體在基因工程和分子生物學(xué)研究中都有廣泛的應(yīng)用，但使用的目的和場景不同。
在具體選擇載體時，需要考慮多種因素，如載體的來源、穩(wěn)定性、拷貝數(shù)、插入片段大小、轉(zhuǎn)化效率等。同時，還需要考慮實驗的目的、所需的表達(dá)水平和宿主細(xì)胞類型等因素。在克隆和表達(dá)過程中，還應(yīng)注意控制實驗條件，確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性。
3.目的基因與載體的酶切+連接
① 目的基因與載體的連接可以通過多種方法實現(xiàn)，以下是其中三種常用的方法：
粘性末端連接：將目的基因與載體用同一種限制酶酶切，產(chǎn)生相同粘性末端，再通過DNA連接酶連接。這是最常用的連接方式，連接效率高。
平端連接：將目的基因與載體切割成平端，用T4 DNA連接酶連接。這種方法需要使用高濃度的DNA和較長的連接時間。
人工接頭連接：先在DNA片段末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。
② 平末端和粘性末端在基因克隆過程中分別在不同的應(yīng)用場景下使用
平末端：在基因克隆中，平末端通常是在限制性核酸內(nèi)切酶識別位點處切割獲得的。這種情況下，限制性核酸內(nèi)切酶在識別序列的中心軸線處切開，產(chǎn)生的就是平末端。這種末端結(jié)構(gòu)在自然界中很少出現(xiàn)，但在一些實驗室技術(shù)中會使用。例如，在一些特殊情況下，例如進(jìn)行基因敲除或同源重組等實驗中，平末端可能會更有效。
粘性末端：相比之下，粘性末端通常是在限制性核酸內(nèi)切酶識別位點處兩側(cè)切開獲得的。這種情況下，限制性核酸內(nèi)切酶在識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開，產(chǎn)生的是粘性末端。這種末端結(jié)構(gòu)在自然界中很少出現(xiàn)，但在一些實驗室技術(shù)中常被使用，特別是在重組DNA技術(shù)中用于構(gòu)建重組DNA分子。粘性末端可以與另一條DNA分子的粘性末端互相配對，形成連接，因此在進(jìn)行DNA重組、連接反應(yīng)時，通常會選擇使用粘性末端。
總之，平末端和粘性末端各有其特點，分別適用于不同的情況。在基因克隆過程中，需要根據(jù)具體的應(yīng)用場景來選擇使用哪種末端結(jié)構(gòu)。
③ 酶切+連接
△ 目的基因與載體的酶切和平/粘性末端連接步驟：
準(zhǔn)備相關(guān)材料：目的基因、載體、不同的限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、緩沖液等。
對目的基因和載體進(jìn)行酶切：根據(jù)實驗設(shè)計，使用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶對目的基因和載體進(jìn)行酶切，產(chǎn)生相同的粘性末端或平末端。
進(jìn)行連接反應(yīng)：在連接緩沖液中加入適量的T4 DNA連接酶，將純化后的目的基因與載體片段混合，進(jìn)行連接反應(yīng)，形成重組DNA。
4.重組DNA轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)
①轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)都是生物學(xué)中常用的術(shù)語，它們的含義和區(qū)別如下：
轉(zhuǎn)化：主要應(yīng)用于原核生物，如大腸桿菌。轉(zhuǎn)化指的是將外源基因通過某些方式導(dǎo)入到原核細(xì)胞內(nèi)，實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。
轉(zhuǎn)染：通常是指將核酸輸送到真核細(xì)胞，有哺乳類動物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞等。比如將重組質(zhì)粒載體或游離核苷酸在脂質(zhì)體等介導(dǎo)下進(jìn)入真核細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染是利用真核細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)特點，將外源基因?qū)氲郊?xì)胞內(nèi)，是基因治療、基因克隆等技術(shù)中的常用術(shù)語。
轉(zhuǎn)導(dǎo)：是指一種特定類型的感染，主要發(fā)生在病毒感染的過程中病毒感染細(xì)胞后，可以通過病毒與細(xì)胞的相互作用將外源基因?qū)氲郊?xì)胞內(nèi)，這種過程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。
②重組DNA轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)：將重組DNA轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞、酵母菌細(xì)胞、植物外植體或動物細(xì)胞內(nèi)。此后，宿主細(xì)胞會產(chǎn)生大量具有相同DNA序列的克隆細(xì)胞。
5.重組克隆細(xì)胞的篩選與鑒定
①目的：通過篩選和鑒定技術(shù)，確認(rèn)宿主細(xì)胞中是否成功插入目標(biāo)基因。
②方法
☆ 直接電泳檢測法：從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，進(jìn)行電泳，通過比較其分子量進(jìn)行篩選與鑒定。
☆ β-半乳糖苷酶顯色法（藍(lán)白篩選法）：將外源DNA克隆到含有編碼α-半乳糖苷酶功能性亞基的lacZα序列的載體中，轉(zhuǎn)化成具有l(wèi)acZΔM15突變的特定大腸桿菌菌株，在提供的無色X-gal被β-半乳糖苷酶水解形成藍(lán)色顏料，通過比較菌落顏色篩選鑒定出含有外源DNA的菌落。
☆ 正向選擇向量：通過將DNA插入片段連接到克隆位點來破壞致死基因的表達(dá)。
☆ 限制酶酶切法：進(jìn)行限制酶消化以確定正確的插入片段。
☆ 菌落PCR：也可以使用PCR篩選細(xì)菌菌落的方法來確定DNA插入物的存在。
6.重組克隆細(xì)胞擴(kuò)增
①擴(kuò)增：將成功插入目標(biāo)基因的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使其快速繁殖，從而獲得大量的含有目的基因的克隆細(xì)胞系。
②將成功插入目標(biāo)基因的宿主細(xì)胞進(jìn)行大量培養(yǎng)，可以通過以下步驟進(jìn)行：
△ 選擇合適的培養(yǎng)條件：根據(jù)宿主細(xì)胞的類型和特性，設(shè)置適合的生長條件，如溫度、濕度、營養(yǎng)物質(zhì)等。
△優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)基：細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞生長和增殖的關(guān)鍵因素之一。通過添加生長因子、激素或其他必要物質(zhì)，優(yōu)化培養(yǎng)基，使其更適于目標(biāo)細(xì)胞的生長和繁殖。
△采用適當(dāng)?shù)募?xì)胞傳代方式：根據(jù)細(xì)胞的生長特性和需要，選擇適當(dāng)?shù)膫鞔绞�。常用的傳代方式有貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)等。
△細(xì)胞克隆和篩選：在初期，需要對細(xì)胞進(jìn)行克隆和篩選，以獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)基因的宿主細(xì)胞系。
7.質(zhì)粒提取
△ 目的：將宿主細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增的重組DNA片段提取出來，獲得多拷貝的目的DNA片段。
以上是分子克隆的一般步驟，后續(xù)根據(jù)自己想要研究的領(lǐng)域（DNA測序、基因表達(dá)/調(diào)控/治療/敲除、疫苗研發(fā)、藥物篩選、動植物育種等），做后續(xù)的實驗研究。
