類器官RNA和蛋白提取方法及步驟

很多老師咨詢類器官RNA和蛋白如何提取，其實類器官可以按微小組織進(jìn)行RNA和蛋白提取，今天小愛給大家講一講提取方法。

 

類器官蛋白提取方法

一、試劑準(zhǔn)備（細(xì)胞漿、細(xì)胞核及細(xì)胞膜蛋白抽提試劑盒(abs9346)）

1、準(zhǔn)備溶液

1）室溫融解試劑盒中的各種溶液，溶解后除結(jié)構(gòu)蛋白提取液外，其他試劑立即置于冰上；

2）結(jié)構(gòu)蛋白提取液溶解后，可放置于37℃水浴中溫浴至透明后，常溫放置。

2、蛋白提取工作液的準(zhǔn)備

1）胞漿蛋白提取工作液的準(zhǔn)備：臨用前，根據(jù)處理樣品的量估算實驗時胞漿蛋白提取液的需要量，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF；

2）胞核蛋白提取工作液的準(zhǔn)備：臨用前，根據(jù)處理樣品的量估算實驗時胞核蛋白提取液的需要量，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF；

3）膜蛋白提取工作液的準(zhǔn)備：臨用前，根據(jù)處理樣品的量估算實驗時膜蛋白提取液的需要量，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF；

4）結(jié)構(gòu)蛋白提取工作液的制備：臨用前，根據(jù)處理樣品的量估算實驗時結(jié)構(gòu)蛋白提取液的需要量，并分別按照1:50比例加入磷酸酶抑制劑II和1:100比例加入蛋白酶抑制劑PMSF。

二、類器官收集及洗滌

1、類器官收集

移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液(abs9730)，輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組），4℃靜置10min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化），300g ，4℃， 離心5min棄上清。

2、類器官清洗

添加1mL類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸，300g ，4℃，離心5min棄上清。

三、類器官蛋白提取

1、胞漿蛋白提取

1）向含類器官沉淀的EP中加入2mL的胞漿蛋白提取工作液，在4℃條件下震蕩20min；

2）準(zhǔn)備1-5mL的注射器，用注射器吹打步驟1震蕩過的溶液50-90次，在4℃條件下，15000g離心10min。取上清液存于EP管中，即為胞漿蛋白。

2、胞核蛋白的提取

取3.1.2步驟獲得的沉淀物加入4mL冰浴的胞漿蛋白提取工作液，在4℃條件下震蕩5min，4℃條件下15000g離心10min，棄去上清液，沉淀物中加入1mL冰凍的胞核蛋白提取工作液，在4℃條件下震蕩5min，4℃條件下15000g離心10min，上清液為細(xì)胞核蛋白，轉(zhuǎn)入EP管并保存。

3、胞膜蛋白的提取

在步驟3.2中的沉淀物中加入1mL冰凍的膜蛋白提取工作液，在4℃條件下震蕩5min，4℃條件下15000g離心10min，上清液為細(xì)胞膜蛋白，轉(zhuǎn)入EP管并保存。

4、結(jié)構(gòu)蛋白的提取

在步驟3.3的沉淀物中加入常溫或37℃水浴過的透明的結(jié)構(gòu)蛋白提取工作液0.5mL，4℃條件下震蕩5min，4℃條件下15000g離心10min，保存上清液即為細(xì)胞骨架蛋白。

5、待測蛋白的保存待檢測濃度的蛋白存于-70℃，可以用于Western，EMSA，footprinting，報告基因檢測以及酶活力測定等后續(xù)操作。

 

類器官RNA提取方法

一、類器官收集及洗滌

1、類器官收集

移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2mL左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液(abs9730)，輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15mL離心管中（24孔板，每5孔為一組），4℃靜置10min或-20℃放置5min（目的是使基質(zhì)膠軟化），300g ，4℃， 離心5min棄上清。

2、類器官清洗

添加1mL類器官傳代培養(yǎng)緩沖液重懸，轉(zhuǎn)移到1.5mL EP管，300g ，4℃，離心5min棄上清。

二、類器官RNA提�。ǔ�純總RNA快速提取試劑盒(含DNase I)，貨號abs60026）

1、向含類器官沉淀的EP中加入1mL的RL（試劑盒組分）溶解細(xì)胞，并用移液槍輕輕吹打混勻，使RL充分和類器官接觸裂解細(xì)胞并滅活RNA酶；
2、將勻漿樣品劇烈震蕩混勻，在15-30°C條件下孵育5min以使核蛋白體完全分解；
3、每1mL RL加0.2mL氯仿。蓋緊樣品管蓋，劇烈振蕩15sec并將其在室溫下孵育3min；
4、于4℃，12000 rpm離心10min，樣品會分成三層：下層有機(jī)相，中間層和上層無色的水相，RNA存在于水相中。水相層的容量大約為所加RL體積的60%，把水相轉(zhuǎn)移到新管中，進(jìn)行下一步操作；
5、加入1倍體積70％乙醇（請先檢查是否已加入無水乙醇!），顛倒混勻（此時可能會出現(xiàn)沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管內(nèi)）；
6、12000 rpm 離心45sec，棄廢液，將吸附柱重新套回收集管；
7、加400μL去蛋白液RE，12000 rpm 離心45sec，棄廢液；
8、DNase I工作液的配制：取10μL DNase I儲存液放入新的RNase-free離心管中，加入70μL RDD溶液，輕柔混勻；
9、向吸附柱RA中央加入80μL DNase I工作液，室溫放置15min（一般情況下室溫放置可得到較好的消化效果，如果室溫效果不佳可選擇在37℃放置15min）；
10、加400μL去蛋白液RE，12000 rpm 離心45sec，棄掉廢液；
11、加入500μL漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇�。�，12000 rpm離心45sec， 棄掉廢液；
12、加入500μL漂洗液RW，12000 rpm 離心45sec，棄掉廢液；
13、將吸附柱RA放回空收集管中，12000 rpm離心2min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)；
14、取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量往吸附膜的中間部位加50-80μL RNase free H2O（事先在 65℃水浴中加熱效果更好），室溫放置2min，12000 rpm 離心1min，所得溶液即為RNA溶液。如果需要較多RNA，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心1min。

 

提取得到的RNA溶液，可以直接應(yīng)用于Northern 雜交、RT-PCR、Real Time RT-PCR、cDNA文庫構(gòu)建、體外翻譯等各種常規(guī)分子生物學(xué)實驗。