以G3BP1協(xié)調(diào)溶酶體自噬活性防止椎間盤退變過程中誘導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡

椎間盤退行性變（IDD）是一個慢性炎性狀態(tài)，其特征是椎間盤（IVD）內(nèi)的髓核（NP）活細(xì)胞喪失和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）破壞。目前，如何提高NP細(xì)胞活力，降低死亡率成為IDD治療發(fā)展的緊迫問題。
溶酶體是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要降解細(xì)胞器。針對溶酶體損傷，溶酶體自噬作為重要的內(nèi)源性保護機制，在防止不可逆細(xì)胞損傷方面發(fā)揮作用。溶酶體自噬是指通過選擇性自噬對受損溶酶體有效清除的過程。溶酶體活性維持正確的細(xì)胞功能，其失調(diào)與多種疾病有關(guān)，包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病或與衰老相關(guān)的疾病。溶酶體損傷參與多種形式的細(xì)胞死亡過程，如細(xì)胞凋亡、壞死、焦亡及鐵死亡等。鐵死亡是指鐵依賴性脂質(zhì)過氧化和活性氧（ROS）誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡。溶酶體通過改變鐵攝取和鐵排出的水平來調(diào)控鐵死亡。當(dāng)涉及到受損的溶酶體和溶酶體自噬活性時，調(diào)節(jié)機制仍然未知。先前的研究表明NP細(xì)胞中存在鐵死亡，并初步探討了其在IDD中的作用。然而，鐵死亡相關(guān)椎間盤退變的潛在機制很復(fù)雜，需要進一步研究。

Ras-GTP酶激活蛋白SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白1（G3BP1）是眾所周知的應(yīng)激顆粒成分，在調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老、免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮作用。最近的研究表明，G3BP1可以調(diào)節(jié)雷帕霉素（mTOR）信號通路機制靶點的激活，起到溶酶體系鏈的作用。這些發(fā)現(xiàn)支持G3BP1可以影響溶酶體的功能，可能包括溶酶體的數(shù)量和活性。因此，有理由懷疑G3BP1在應(yīng)力條件下調(diào)節(jié)溶酶體自噬活性和溶酶體修復(fù)。此外，在IDD進展過程中，G3BP1與mTOR信號通路之間的關(guān)系仍需在NP細(xì)胞中驗證。
最近，在華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科團隊的一項研究中，推測G3BP1通過在IDD過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵死亡介導(dǎo)溶酶體自噬和溶酶體活性，并進一步研究了G3BP1和mTOR信號在體內(nèi)椎間盤退變模型中的作用。該研究加深了對NP細(xì)胞G3BP1、溶酶體自噬和鐵死亡之間關(guān)系的認(rèn)識，為IDD治療提供了新的靶點。
首先，實驗測量了G3BP1和Galectin-3（溶酶體損傷的標(biāo)志物）在人NP組織中的表達水平。結(jié)果表明，在退變NP組織中G3BP1表達水平低，Galectin-3表達水平高，而且G3BP1和Galectin-3 水平均與NP組織的退行性分級相關(guān)。這表明，在IDD的進展過程中，G3BP1的水平逐漸降低，溶酶體損傷增加。
壓縮力是IDD的常見致病因素。因此實驗利用體外靜態(tài)壓縮力裝置（1.0 MPa）來模擬NP細(xì)胞周圍的外部環(huán)境。LLOMe（L-亮氨酸甲酯的二肽縮合物）能夠在溶酶體中積累，并用于誘導(dǎo)溶酶體損傷。結(jié)果觀察到，Galectin-3的蛋白質(zhì)水平在壓縮組和LLOMe組中均增加（圖1 A），而且壓縮力處理誘導(dǎo)Galectin-3陽性溶酶體在NP細(xì)胞中的積累（圖1 B）。它揭示了NP細(xì)胞在壓縮壓力下溶酶體損傷的增加。另一方面，發(fā)現(xiàn)壓縮處理增加了NP細(xì)胞的死亡率（圖1 C）。

為了進一步研究是否發(fā)生鐵死亡，將NP細(xì)胞與DCFH-DA探針一起孵育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在加壓處理后，細(xì)胞ROS水平升高（圖1 D），GPX4和FTL的蛋白質(zhì)水平均降低（一些蛋白質(zhì)，如谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）和鐵蛋白輕鏈（FTL）參與調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵死亡）（圖1 E）。結(jié)果表明，在壓縮壓力下溶酶體損傷伴有細(xì)胞鐵死亡。同時，加壓組細(xì)胞游離鐵濃度升高（圖1 F）。游離鐵可能從嚴(yán)重受損的溶酶體中釋放出來。脂質(zhì)ROS水平表示脂質(zhì)過氧化的程度，這是鐵死亡的標(biāo)志。結(jié)果表明，壓縮和LLOMe處理均誘導(dǎo)脂質(zhì)ROS水平升高（圖1 G、H）。這些結(jié)果表明，壓縮處理誘導(dǎo)溶酶體損傷，進而加重NP細(xì)胞的鐵死亡。
Trim16 是一種 E3 泛素連接酶，在溶酶體自噬起始中發(fā)揮作用，并募集接頭蛋白 VCP/p97來誘導(dǎo)溶酶體自噬。接下來，實驗觀察到Trim16和p97的水平在加壓期間發(fā)生了變化。長時間的壓力處理似乎損害了溶酶活性以及G3BP1的水平。為了進一步揭示G3BP1在溶酶體自噬中的作用，siRNAs被用來敲低G3BP1的表達。結(jié)果表明，G3BP1敲低降低了Trim16的表達并誘導(dǎo)了p97的積累。同時，溶酶體自噬活性降低與ROS水平升高有關(guān)。G3BP1敲低組的細(xì)胞游離鐵和脂質(zhì)過氧化水平升高。這表明G3BP1功能障礙加重細(xì)胞鐵死亡。實驗發(fā)現(xiàn)G3BP1功能障礙誘導(dǎo)Galectin-3的積累和溶酶體損傷，這對于在壓縮壓力下加劇鐵死亡至關(guān)重要。

G3BP1被認(rèn)為是組裝應(yīng)激顆粒（SGs）的中心開關(guān)。因此打算確定G3BP1是否參與壓縮壓力下的SG的形成。亞砷酸鹽可誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒組裝。結(jié)果表明，壓縮組G3BP1相關(guān)SG的形成不如亞砷酸鹽組明顯。這表明，G3BP1更可能作為溶酶體活性的調(diào)節(jié)劑，同時在壓縮壓力下也可能充當(dāng)SG成分。
哺乳動物雷帕霉素靶標(biāo)蛋白（mTOR）信號控制溶酶體代謝途徑。因此懷疑G3BP1通過mTOR信號調(diào)節(jié)溶酶體活性。結(jié)果表明，在壓縮壓力下磷酸化的mTOR水平降低，表明mTOR信號受到抑制（圖2 A）。NP細(xì)胞用mTOR信號激活劑MHY1485或特異性mTOR抑制劑雷帕霉素處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶酶體自噬活性同時被mTOR激活劑抑制，并被mTOR抑制劑激活（圖2 B）。此外，MHY1485處理還誘導(dǎo)NP細(xì)胞中ROS水平升高（圖2 C）。mTOR激活組細(xì)胞游離鐵濃度和脂質(zhì)ROS水平升高，在mTOR抑制組降低（圖2 D-F）。細(xì)胞死亡率在MHY1485組顯著升高，在雷帕霉素組降低（圖2 G）。這表明，mTOR信號傳導(dǎo)的激活加重了細(xì)胞鐵死亡，這與G3BP1敲低的效果相似。此外，MHY1485處理促進溶酶體損傷，而雷帕霉素改善了溶酶體損傷（圖2 H、I）。這些結(jié)果表明，G3BP1通過mTOR信號調(diào)節(jié)溶酶體自噬和細(xì)胞鐵死亡。

然后，為了進一步研究G3BP1在mTOR信號中的作用，研究人員打算揭示G3BP1與mTOR復(fù)合體的結(jié)合。實驗觀察G3BP1與mTOR亞基TSC2的結(jié)合。TSC2的敲低誘導(dǎo)磷酸化mTOR水平升高，顯著抑制溶酶體自噬的活化，降低鐵死亡相關(guān)保護蛋白的水平，還誘導(dǎo)Galectin-3表達升高，表明溶酶體損傷加重。這些結(jié)果表明，G3BP1/TSC2 復(fù)合體使 mTOR 信號失活，以調(diào)節(jié)溶酶體自噬和NP細(xì)胞的鐵死亡。 最后，為了評估G3BP1對IDD的影響，建立了椎間盤退變模型，將靶向G3BP1的siRNAs注射到大鼠椎間盤中，并評估椎間盤的退變程度。結(jié)果表明，G3BP1的敲低促進了IDD在體內(nèi)的進展。

為了進一步了解IDD進展過程中的G3BP1/mTOR信號，在椎間盤退變模型中使用了靶向mTOR信號的藥物。結(jié)果表明，MHY1485提高了椎間盤的MRI分級，與IDD組相同（圖3 A、B）。MHY1485組椎間盤高度較對照組顯著降低（圖3 C、D）。然而，雷帕霉素可以部分改善IDD進展過程中水分含量和椎間盤高度的損失。與IDD組相比，雷帕霉素組MRI分級較低，椎間盤高度指數(shù)（DHI）較高。此外，MHY1485組和IDD組NP區(qū)被纖維組織取代（圖3 E）。與MHY1485和IDD組相比，雷帕霉素組的退變分級較低，表明椎間盤的退變特征不太明顯（圖3 F）。這些結(jié)果表明，mTOR 信號失活會延緩體內(nèi) IDD 的進展，G3BP1/mTOR信號參與體內(nèi)IDD的進展，可能為IDD治療提供潛在的靶點。
G3BP1 協(xié)調(diào) TSC/mTOR 復(fù)合體以啟動溶酶體自噬以去除損傷的溶酶體。在壓縮壓力下，G3BP1功能障礙促進溶酶體自噬的失活。受損溶酶體的積累誘導(dǎo)游離鐵和脂質(zhì)過氧化水平升高，導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡。
總之，該研究調(diào)查了溶酶體自噬、溶酶體損傷和細(xì)胞鐵死亡之間的關(guān)系。G3BP1作為核心鏈接協(xié)調(diào)溶酶體自噬活性以清除損傷的溶酶體，從而抑制細(xì)胞游離鐵的過載。在壓縮壓力下，G3BP1似乎主要存在于溶酶體中，通過TSC2 / mTOR信號調(diào)節(jié)溶酶體功能，而不是形成應(yīng)激顆粒。這些發(fā)現(xiàn)說明了G3BP1和mTOR信號在NP細(xì)胞鐵死亡中的作用，并可能為IDD提供潛在的治療靶點。

參考文獻：Li S, Liao Z, Yin H, Liu O, Hua W, Wu X, Zhang Y, Gao Y, Yang C. G3BP1 coordinates lysophagy activity to protect against compression-induced cell ferroptosis during intervertebral disc degeneration. Cell Prolif. 2023 Mar;56(3):e13368. doi: 10.1111/cpr.13368. Epub 2022 Nov 30. PMID: 36450665; PMCID: PMC9977669.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36450665/

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