化學(xué)發(fā)光western blot實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵技巧及流程介紹

基于化學(xué)發(fā)光的western blot 實(shí)驗(yàn)技術(shù)是目前蛋白質(zhì)檢測(cè)的主流方法。此技術(shù)的實(shí)驗(yàn)原理是樣品特異性結(jié)合一抗和HRP酶聯(lián)二抗后，加入化學(xué)發(fā)光底物，酶催化底物發(fā)光。在發(fā)光檢測(cè)環(huán)節(jié)中，傳統(tǒng)方法使用壓片（x光片）檢測(cè)，隨著科技的發(fā)展，目前主要使用數(shù)字化成像系統(tǒng)（如chemiSOLO化學(xué)發(fā)光成像儀）進(jìn)行成像檢測(cè)。

化學(xué)發(fā)光western blot 方法的優(yōu)勢(shì)是高達(dá)fg 級(jí)的檢測(cè)靈敏度，是確定目的蛋白表達(dá)與否的比較常規(guī)的定性檢測(cè)，可用于檢測(cè)外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，確認(rèn)純化的某種已知蛋白，或進(jìn)行抗體的驗(yàn)證等。
 

化學(xué)發(fā)光western blot示意圖

化學(xué)發(fā)光western blot實(shí)驗(yàn)操作流程較為復(fù)雜，需要優(yōu)化的點(diǎn)也非常多。其中，高背景就是困擾廣大科研工作者最常見的問題之一：如整體的高背景將目的蛋白信號(hào)淹沒；亮點(diǎn)、斑塊隨機(jī)散布在印跡膜上。那么，如何獲得目的蛋白低背景、高信號(hào)強(qiáng)度（高信噪比）的檢測(cè)結(jié)果呢？

答案來了！
化學(xué)發(fā)光western 完美實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵技巧：
· 優(yōu)化蛋白上樣量�？蛇M(jìn)行梯度稀釋，確定最佳上樣量，也可保證成像儀獲取最佳成像數(shù)據(jù)。
· 選擇合適的印跡膜，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求可選擇NC膜和PVDF膜。
· 保持潔凈，使用前對(duì)托盤等設(shè)備進(jìn)行清洗，戴手套處理凝膠，用鑷子處理膜等。
· 確認(rèn)所有的buffer都混合均勻，尤其是封閉液和抗體孵育buffer，若混合不均勻，極易引起高背景，buffer最好過濾后使用。
· 如果背景較高，可使用大劑量的洗滌buffer清洗或者增加洗膜的間隔時(shí)間和次數(shù)。
· 嘗試使用不同的封閉液，某些抗體可能會(huì)與封閉液反應(yīng)引起高背景，某些封閉液可能阻礙抗體和目的蛋白的結(jié)合，脫脂牛奶和牛血清白蛋白BSA是最常用的印跡膜封閉液，封閉液可用作一抗的稀釋液，減少非特異性條帶的出現(xiàn)。
· 可采用點(diǎn)雜交的方法摸索一抗和二抗的最佳稀釋比例，能較好的降低背景。
· 不要使用帶有疊氮化鈉的抗體稀釋液稀釋辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗體，因?yàn)榀B氮化鈉會(huì)抑制HRP 的活性。
· 使用足夠多的底物，確認(rèn)印跡膜孵育均勻。
· 嘗試使用不同底物增加靈敏度和信號(hào)持續(xù)時(shí)間，不同底物適用于不同印跡膜的檢測(cè)，有的適用低豐度蛋白，有的適合高豐度蛋白；不同底物具有不同反應(yīng)時(shí)間和持續(xù)時(shí)間，從而影響成像效果。
· 為增加酶活性，化學(xué)發(fā)光底物使用前需在室溫下進(jìn)行平衡。
· 使用數(shù)字成像檢測(cè)遠(yuǎn)優(yōu)于膠片，數(shù)字成像的動(dòng)態(tài)范圍較寬，不易出現(xiàn)過飽和現(xiàn)象，且具有過飽和提示功能。