DPSCs通過分泌骨保護(hù)素和髓系細(xì)胞中的AKT信號失活來抑制破骨細(xì)胞分化

破骨細(xì)胞（OCs）是多核巨細(xì)胞，在病理刺激的影響下（如核因子κβ配體的受體激活劑RANKL），由單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系分化而來，有助于骨吸收和重塑。成骨細(xì)胞（OB）、OCs、骨細(xì)胞和其他骨髓細(xì)胞之間精確而有序的分子通訊是調(diào)節(jié)骨形成和吸收所必需的。破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收的主要開關(guān)是RANKL，一種由活化OBs釋放的細(xì)胞因子。然而，在各種病理條件下，如關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥和佩吉特骨病，OC介導(dǎo)的骨過度吸收是很明顯的。

骨質(zhì)破壞的本質(zhì)是通過與滑膜成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞相互作用專門激活了OCs。差異激活的巨噬細(xì)胞在各種類型的細(xì)胞骨架和其他炎癥相關(guān)疾病的病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用，一般來說，M1和M2骨髓細(xì)胞分別參與引發(fā)和消退炎癥。因此，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極性的細(xì)胞治療策略可能通過影響骨質(zhì)疏松癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病中不受控制的破骨細(xì)胞分化來提供顯著優(yōu)勢。

骨保護(hù)素（OPG）是TNF受體超家族的分泌性糖蛋白，對成骨細(xì)胞分化至關(guān)重要，由于其在抑制破骨細(xì)胞分化中的作用，也被稱為破骨細(xì)胞生成抑制因子（OCIF）。OBs通過產(chǎn)生OPG來負(fù)調(diào)節(jié)OC的分化和功能。研究表明，OPG抑制OC分化，并通過隔離RANKL充當(dāng)誘餌受體，可阻斷 RANK 信號并抑制骨吸收。

牙髓來源的干細(xì)胞（DPSCs）是自牙髓中分離的一種間充質(zhì)干細(xì)胞，具有自我更新、多向分化能力，并具有促進(jìn)血管生成和骨組織修復(fù)潛力。此外，DPSCs還被證明具有免疫抑制作用，提示人類DPSCs可用于炎癥和自身免疫性疾病，DPSCs分泌多種生長因子和細(xì)胞因子，這些因子對各種細(xì)胞具有旁分泌活性，以實現(xiàn)其功能和分化。

基于此，美國德克薩斯理工大學(xué)健康科學(xué)中心的一項研究曾重點闡明了單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系 DPSCs對單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系 RAW 264.7 細(xì)胞分化為OCs發(fā)揮抑制作用的潛在機制。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 Journal of Cellular and Molecular Medicine 期刊題為“Dental pulp–derived stem cells inhibit osteoclast differentiation by secreting osteoprotegerin and deactivating AKT signalling in myeloid cells”。
 

 

首先，為了研究DPSCs對破骨細(xì)胞分化的影響，在有或沒有DPSCs 狀態(tài)下在無接觸共培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞（RAW 264.7），同時，細(xì)胞培養(yǎng)基補充巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）和sRANKL以誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞方向分化。TRAP染色顯示，在用M-CSF和sRANKL刺激的細(xì)胞培養(yǎng)板中觀察到多核破骨細(xì)胞，而沒有M-CSF和sRANKL培養(yǎng)的對照RAW 264.7細(xì)胞中沒有顯示任何多核TRAP陽性細(xì)胞。然而，在DPSCs存在時，同一時間點的多核TRAP陽性細(xì)胞的豐度明顯降低。當(dāng)DPSC：RAW 264.7細(xì)胞比例為1:10時，觀察到破骨細(xì)胞豐度的劑量依賴性減少，其抑制作用比細(xì)胞比例為1：100時更有效。與沒有DPSCs的RAW 264.7細(xì)胞相比，在無接觸共培養(yǎng)條件下，在DPSCs存在下分化的RAW 264.7細(xì)胞中TRAP陽性的多核細(xì)胞數(shù)量明顯減少。這些觀察表明，DPSCs能夠抑制破骨細(xì)胞分化。

然后，進(jìn)一步驗證了DPSCs對破骨細(xì)胞分化的影響，在存在或不存在無接觸DPSCs共培養(yǎng)的情況下，評估了RAW 264.7細(xì)胞在誘導(dǎo)分化6天后各種破骨細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因的mRNA表達(dá)。定量PCR分析顯示，分化后的破骨細(xì)胞相關(guān)基因，如Nfatc1、組織蛋白酶K（Ctsk）、Rank、Trap和MMP9等關(guān)鍵基因顯著上調(diào)。這些結(jié)果證實了RAW 264.7細(xì)胞成功分化為OCs。然而，在DPSCs存在下，破骨細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因（如Nfatc1、Ctsk、Rank、Trap和Mmp9）的mRNA表達(dá)以劑量依賴性方式顯著降低。

為了確認(rèn)基因表達(dá)向蛋白質(zhì)的翻譯，在分化6天后，對分離的總蛋白質(zhì)進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析。與未分化細(xì)胞相比，破骨細(xì)胞分化細(xì)胞中NFATc1、Ctsk、MMP9和p65的蛋白質(zhì)水平顯著升高，然而，當(dāng)在DPSC以劑量依賴性方式存在誘導(dǎo)分化時，蛋白質(zhì)水平明顯降低。此外，與對照RAW 264.7細(xì)胞相比，分化細(xì)胞中的NFATc1、Ctsk、MMP9和TRAP陽性多核OCs顯著增加（圖1 A、B），而在DPSCs存在下觀察到分化相關(guān)蛋白的數(shù)量顯著減少（圖1 A、B）。

圖1 DPSCs抑制RAW 264.7細(xì)胞中的破骨細(xì)胞分化相關(guān)分子。
 

DPSCs具有免疫調(diào)節(jié)作用，并可能進(jìn)一步調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化過程。因此，接下來測試了DPSCs在RAW 264.7細(xì)胞中是否有任何免疫調(diào)節(jié)作用，在存在或不存在DPSCs的情況下對RAW 264.7細(xì)胞進(jìn)行了無接觸共培養(yǎng)。與對照組相比，在DPSCs存在下，炎癥基因之一TNF-α的表達(dá)顯著下調(diào)（圖2 A），相反，IL-4Rα，一種抗炎基因的mRNA表達(dá)上調(diào)（圖2 A）。此外，作為RAW 264.7細(xì)胞M2表型特征的精氨酸酶1（Arg1），Ym1（Chil3）顯著增加（圖2 B）。這些數(shù)據(jù)表明，DPSCs可能具有將巨噬細(xì)胞極化為抗炎表型的能力，從而負(fù)向調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化。

為了進(jìn)一步了解DPSCs調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞分化的機制，在無接觸共培養(yǎng)條件下在存在或不存在DPSCs的情況下，還評估了RAW 264.7細(xì)胞在誘導(dǎo)分化6天后破骨細(xì)胞抑制因子骨保護(hù)素（OPG）的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)。定量PCR分析顯示，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化6 天后，RAW 264.7細(xì)胞OPG mRNA顯著降低。然而，在DPSCs存在下誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞分化為OCs時，OPG的mRNA表達(dá)以劑量依賴性方式顯著增加。然后，使用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)確定了哪些細(xì)胞在OCs分化過程中分泌OPG，發(fā)現(xiàn)從對照 RAW 264.7 細(xì)胞或分化 OCs 收集的上清液中沒有可檢測到的 OPG 范圍。然而，在整個分化過程中，在DPSCs存在下，培養(yǎng)上清液中的OPG水平顯著升高。這些結(jié)果表明，RAW 264.7細(xì)胞可能沒有分泌OPGs。

進(jìn)一步地，為了確定DPSC是否可以表達(dá)和分泌組成型DPSCs，在不同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)DPSCs，在血清饑餓條件下（含1% FBS的DMEM），在培養(yǎng)48和72小時后收集上清液。OPG的mRNA表達(dá)顯示，與用含10% FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)的DPSCs相比，血清饑餓在兩個時間點均顯著誘導(dǎo)DPSCs中的OPG表達(dá)。然后測量了上清液中分泌的OPG量，發(fā)現(xiàn)血清饑餓后OPG水平顯著升高。進(jìn)一步研究的證實了DPSC在含10% FBS和在受損環(huán)境下的培養(yǎng)基中均分泌了OPG。這些觀察表明，DPSCs可以在脅迫條件下分泌組成型OPG，培養(yǎng)基對OPG分泌沒有顯著影響。

為了研究OPG對破骨細(xì)胞分化相關(guān)分子的影響，在存在或不存在不同濃度的重組OPG的情況下誘導(dǎo)了RAW 264.7細(xì)胞的破骨細(xì)胞分化，并進(jìn)行了實時RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析。分析顯示，在破骨細(xì)胞分化6天后，在OPG存在下，關(guān)鍵的破骨細(xì)胞相關(guān)基因（如Nfatc1、Ctsk、Rank、Trap和Mmp9）顯著降低（圖3 A）。此外，與分化的OCs相比，存在OPG時，關(guān)鍵破骨細(xì)胞相關(guān)蛋白NFATc1、Ctsk 和MMP9水平降低（圖3 B）。這些觀察結(jié)果支持OPG抑制破骨細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物分子的能力。