Pippin系列全自動(dòng)核酸電泳片段回收儀用于外泌體small RNA研究

背景知識(shí)：

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles, EV）是由細(xì)胞釋放到胞外，由脂質(zhì)雙分子層包裹的微小囊泡。近年來(lái)，研究者對(duì)血液樣本中EV分析越來(lái)越感興趣，主要源于細(xì)胞分泌的EV攜帶多種物質(zhì)如核酸，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)等，可以作為生物標(biāo)志物，表征細(xì)胞發(fā)生的病理生理過(guò)程。由于血液成分的復(fù)雜性阻礙了EV的準(zhǔn)確檢測(cè)，從而減緩了其在臨床應(yīng)用中的發(fā)展。目前已有多個(gè)研究證明，不同EV回收方法得到的不同回收效率和純度的EV，會(huì)影響血液樣本中基于EV的生物標(biāo)志物分析。雖然研究人員已在嘗試?yán)砬逭麄�(gè)EV檢測(cè)流程中，包括血液采集管（BCT）的類型以及血液處理間隔（BPI）（即血液采集和處理之間的時(shí)間）等因素，但真實(shí)影響情況仍未明確。另外，沒(méi)有適當(dāng)且可量化的指標(biāo)可用于幫助選擇最適合研究目標(biāo)的BCT和BPI。因此，建立和驗(yàn)證BCT和BPI的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）仍然是迫切需要解決的問(wèn)題，這也是建立可靠臨床相關(guān)的生物庫(kù)的先決條件，以及EV相關(guān)生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證的前提條件。

 

2023年3月，比利時(shí)根特大學(xué)Bert Dhondt等在《Journal Of Extracellular Vesicles》雜志上發(fā)表了題為：Benchmarking blood collection tubes and processing intervals for extracellular vesicle performance metrics的研究論文。作者詳細(xì)評(píng)估了11種BCT對(duì)9項(xiàng)性能指標(biāo)的影響，包括血樣質(zhì)量、EV穩(wěn)定性、EV血細(xì)胞來(lái)源和EV相關(guān)蛋白質(zhì)組和小RNA轉(zhuǎn)錄組特征等，并對(duì)三個(gè)臨床相關(guān)樣本的BPI進(jìn)行了額外評(píng)估（如圖1）。

實(shí)驗(yàn)方法：

從健康人和癌癥患者處獲取血液樣本，經(jīng)血液指標(biāo)分析與溶血分析后，合格血液樣本進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用已有的分離方案，結(jié)合體積排除色譜（size-exclusion chromatography, SEC）和Optiprep密度梯度超速離心（ODG），從血清和血小板貧化血漿（Platelet depleted plasma, PDP）樣品中分離EV。繼而對(duì)分離獲得的EV進(jìn)行物理表征，涉及尺寸和形態(tài)，同時(shí)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和二代測(cè)序等對(duì)EV進(jìn)行蛋白組和轉(zhuǎn)錄組信息表征。其中 small RNA的文庫(kù)制備，由sage science公司的 Pippin系列全自動(dòng)核酸電泳片段回收儀結(jié)合3% agarose預(yù)制膠，精準(zhǔn)回收125-153 bp范圍的small RNA，去除雜帶，使得測(cè)序結(jié)果聚焦目標(biāo)small RNA，清晰展現(xiàn)EV的small RNA圖譜。

 

在本文中，作者進(jìn)行了第一次大規(guī)模EV血液標(biāo)準(zhǔn)（EV Blood Benchmarking , EVBB）研究，全面比較了BCT（n=11）和BPI（n=3）對(duì)EV分析的影響，目的是建立改進(jìn)的血液EV分析程序，開(kāi)發(fā)并實(shí)施了反映樣本質(zhì)量、EV回收率、血細(xì)胞衍生的EV亞型的離體釋放以及EV相關(guān)分子特征的性能指標(biāo)。基于這些發(fā)現(xiàn)，本文為研究人員提供了一般性建議，指導(dǎo)根據(jù)情況選擇相應(yīng)的BCT和BPI（圖2）。EVBB研究有助于血液EV研究的方法標(biāo)準(zhǔn)化，該研究提供了性能指標(biāo)，可作為新開(kāi)發(fā)的BCT、額外BPI以及其他因素分析的框架，并支持EV研究方法的進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化。

引用文獻(xiàn)：

Dhondt, Bert, et al. "Benchmarking blood collection tubes and processing intervals for extracellular vesicle performance metrics." Journal of Extracellular Vesicles 12.5 (2023): e12315.

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