iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元與體內(nèi)動物模型進(jìn)行抗癲癇藥物開發(fā)的新策略詳解

近日，南昌大學(xué)藥學(xué)院張春波團(tuán)隊(duì)和Monash University神經(jīng)科學(xué)系Patrick Kwan團(tuán)隊(duì)在Journal of Advanced Research（IF=10.7）上發(fā)表了題為“An integrated in vitro human iPSCs-derived neuron and in vivo animal approach for preclinical screening of anti-seizure compounds”的研究論文，建立了整合體外人源誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）誘導(dǎo)神經(jīng)元和體內(nèi)動物模型進(jìn)行抗癲癇藥物開發(fā)的新方法，該方法具有保留人類基因遺傳背景和高通量篩選的優(yōu)勢，打破了傳統(tǒng)抗癲癇藥物開發(fā)過程中的物種影響和成本禁錮，有望提高藥物的篩選效率和成功率，通過該方法，研究者從14種天然化合物中鑒定出多種具有抗癲癇效果的化合物。南昌大學(xué)藥學(xué)院張春波教授和Monash University神經(jīng)科學(xué)系Patrick Kwan教授為論文共同通訊作者，南昌大學(xué)藥學(xué)院博士研究生趙春芳和Monash University神經(jīng)科學(xué)系研究員Ben Rollo博士為論文共同第一作者。

研究者首先通過神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子Neurogenin2，NGN2）將iPSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)元，并通過免疫熒光染色和多電極陣列（Multielectrode array，MEA）體外電生理檢測確認(rèn)神經(jīng)元特征，然后用促驚厥藥4-氨基吡啶（4-aminopyridine，4-AP）建立了iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元癲癇模型（圖1）。

圖1 iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元癲癇模型的構(gòu)建

研究者利用一線抗癲癇藥物卡馬西平（carbamazepine, CBZ）和苯妥英鈉（phenytoin sodium，PHT）和已報(bào)道過具有抗癲癇潛力的天然化合物α-細(xì)辛腦（α-asarone，ASA）和姜黃素（curcumin，CUR）在24孔MEA板驗(yàn)證了iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元癲癇模型識別抗癲癇化合物的適用性 (圖2)。

圖2 卡馬西平、苯妥英鈉、α-細(xì)辛腦、姜黃素在iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)癲癇模型的抗癲癇效果驗(yàn)證

研究者在96孔MEA板測試了另外12種天然化合物，即長春西�。╲inpocetine， VIN），厚樸酚（magnolol，MAG），川芎嗪（ligustrazine，LIG），蛇床子素（Osthole，OST)，丹參酮ⅱA（Tanshinone ⅱA，TAN），胡椒堿（Piperine， PIP），天麻素（gastrodin，GAS），槲皮素（quercetin，QUE），小檗堿（Berberine，BER），白楊素（chrysin，CHR），五味子甲素（Schizandrin A， SCH）和白藜蘆醇（resveratrol，RES）。五味子甲素、厚樸酚和長春西汀在10µM和100µM時(shí)均可降低4-AP誘導(dǎo)的神經(jīng)元放電率，小檗堿、蛇床子素和胡椒堿在100µM時(shí)完全抑制4-AP誘導(dǎo)的神經(jīng)元放電(圖3)。

為了驗(yàn)證iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞模型的可靠性，研究者評估了化合物對PTZ誘導(dǎo)的斑馬魚癲癇模型的作用。結(jié)果顯示，卡馬西平在50µg/mL和100µg/mL時(shí)呈劑量依賴性抑制PTZ誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作，α-細(xì)辛腦、胡椒堿和蛇床子素在10µg/mL、50µg/mL和100µg/mL時(shí)顯著降低PTZ誘導(dǎo)的癲癇活動，厚樸酚在5µg/mL、10µg/mL和20µg/mL時(shí)顯著降低PTZ誘導(dǎo)的癲癇活動，長春西汀和小檗堿在100µg/mL和200µg/mL下也有抗癲癇作用（圖4）。

圖4 天然化合物在斑馬魚癲癇模型中的抗癲癇效果

為了進(jìn)一步比較體內(nèi)和體外模型的一致性，研究者在PTZ誘導(dǎo)小鼠癲癇模型中，測試了在iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元中表現(xiàn)出抗癲癇作用的8種天然化合物的抗癲癇能力。200mg/kg 卡馬西平降低了小鼠的全面強(qiáng)直陣攣發(fā)作頻率；100mg/kg厚樸酚顯著降低了癲癇發(fā)作頻率，并延長了首次癲癇發(fā)作的潛伏期；胡椒堿在100 mg/kg、200 mg/kg和300 mg/kg劑量下顯著抑制癲癇發(fā)作次數(shù)，并有明確的劑量依賴性反應(yīng)；α-細(xì)辛腦在120 mg/kg和150 mg/kg時(shí)具有顯著抑制作用；蛇床子素在300 mg/kg時(shí)具有顯著的抑制癲癇作用；300 mg/kg和1 g/kg劑量的姜黃素延長了癲癇發(fā)作的潛伏期，但對癲癇發(fā)作次數(shù)無顯著影響，提示有輕度抑制作用(圖5)。研究者還在小鼠急性發(fā)作模型中評估了在iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元和斑馬魚中篩選出的6種陰性化合物，即白楊素，天麻素，白藜蘆醇，槲皮素，川芎嗪和丹參酮ⅱa，結(jié)果顯示這些化合物均未降低癲癇發(fā)作頻率，也未延長首次癲癇發(fā)作潛伏期。

最后，研究者比較分析了用于化合物篩選的iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元、斑馬魚和小鼠模型的一致性。8種天然化合物（胡椒堿，厚樸酚，α-細(xì)辛腦，蛇床子素，姜黃素，長春西汀，小檗堿，五味子甲素）抑制了iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元的癲癇樣活動，在這8種化合物中，有6種（胡椒堿、厚樸酚、α-細(xì)辛腦、蛇床子素、長春西汀、小檗堿）在斑馬魚PTZ模型中表現(xiàn)出抗癲癇作用，5種（胡椒堿、厚樸酚、α-細(xì)辛腦、蛇床子素、姜黃素）在小鼠PTZ模型中表現(xiàn)出強(qiáng)的抗癲癇作用(圖6）。值得注意的是，在iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元模型中無效的化合物在斑馬魚或小鼠模型中均未顯示出抗癲癇作用。

圖6 三種模型的比較

該研究開發(fā)了一種新的整合體內(nèi)外模型的抗癲癇藥物篩選模式，兼具人類基因遺傳背景和高通量特性，有望進(jìn)一步促進(jìn)抗癲癇藥物開發(fā)。利用這種方法，研究者在體外鑒定出了8種具有抗癲癇作用的天然化合物。其中，胡椒堿，厚樸酚，α-細(xì)辛腦和蛇床子素在兩個(gè)體內(nèi)模型中也顯示出減少癲癇發(fā)作的能力，表明它們是進(jìn)一步藥物開發(fā)的潛在候選者。重要的是，通過比較分析，在體外模型中無效的化合物在兩個(gè)體內(nèi)模型中均無抗癲癇作用，這表明iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)模型在識別無效化合物(這是高通量篩選方法的關(guān)鍵屬性)方面具有較高的陰性預(yù)測值，以減少用于進(jìn)一步體內(nèi)評估的化合物數(shù)量。此外，這種整合方法彌補(bǔ)了單一篩選模型特有的局限性，例如在iPSCs誘導(dǎo)神經(jīng)元中簡化了的大腦環(huán)境和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，以及斑馬魚和小鼠模型中缺乏的人類遺傳背景。該研究在未來需進(jìn)一步完善。首先，為了識別具有新機(jī)制和靶點(diǎn)的化合物，未來需要篩選更大的化合物庫；其次，誘導(dǎo)的NGN2神經(jīng)培養(yǎng)物和化學(xué)驚厥劑誘導(dǎo)的短暫癲癇樣放電代表了大腦的高度簡化模型，從而限制了完全重現(xiàn)大腦環(huán)境和癲癇網(wǎng)絡(luò)的能力，其他更復(fù)雜的藥物篩選模型(如患者來源的類器官、組織)可能有助于克服這些局限性；第三，研究中確定的有效化合物需要詳細(xì)的機(jī)制研究。

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