在造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞（HSPC）培養(yǎng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測的非侵入性方法詳解

Presens的SDR SensorDish®Reader可以在從人臍帶血中分離的造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞（HSPC）培養(yǎng)過程中對體外氧濃度進(jìn)行定量。在實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)液中氧濃度的同時(shí)，檢測模擬生理氧濃度對HSPC增殖、細(xì)胞周期狀態(tài)以及干細(xì)胞表型或分化細(xì)胞類型標(biāo)志物表達(dá)的影響。這項(xiàng)研究證明了該系統(tǒng)在有效模擬體內(nèi)氧氣環(huán)境的條件下檢測細(xì)胞表型和功能的有效性。

一、HSPC在生理氧濃度下的培養(yǎng)

從人臍帶血中分離的CD133 HSPC細(xì)胞在24孔OxoDish®中培養(yǎng)長達(dá)一周。每隔2-3天，取出細(xì)胞和培養(yǎng)液，短暫離心(1500rpm；5min)，并將細(xì)胞仔細(xì)地懸浮在適當(dāng)氧濃度（1%、8% 或 20%）預(yù)孵育1h的培養(yǎng)液中。在這項(xiàng)細(xì)胞培養(yǎng)研究中，低氧環(huán)境是使用插入傳統(tǒng)CO2培養(yǎng)箱(圖1)的缺氧室實(shí)現(xiàn)的。在整個(gè)孵育期內(nèi)，用SDR在線監(jiān)測實(shí)時(shí)氧濃度。同時(shí)，在相同條件下，根據(jù)測定方法，在24孔板或6孔板中培養(yǎng)HSPC細(xì)胞。更換介質(zhì)時(shí)，取出等分試樣并使用計(jì)數(shù)器確定細(xì)胞數(shù)。在生理氧濃度(1%或8%)或環(huán)境氧濃度(20%)培養(yǎng)條件下，流式細(xì)胞儀測定DNA含量可用于檢測HSPC細(xì)胞周期狀態(tài)。同樣，使用凋亡試劑盒(BD)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞凋亡水平進(jìn)行量化。在蛋白質(zhì)水平，用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)分析干/祖細(xì)胞或分化細(xì)胞的胞外標(biāo)志物的表達(dá)模式(結(jié)果未顯示)。

圖1：SDR用于監(jiān)測HSPC培養(yǎng)過程中的體外氧濃度，將SDR連接到計(jì)算機(jī)（B）允許在實(shí)驗(yàn)期間對HSPC培養(yǎng)基中的氧濃度進(jìn)行非侵入性實(shí)時(shí)測量。
 

二、結(jié)果

圖2顯示了在各種氧氣環(huán)境中進(jìn)行為期兩天的 HSPC 培養(yǎng)期間，SDR和OxoDish®聯(lián)合測量的體外氧分壓。HSPC在1%O2中培養(yǎng)時(shí)的平均氧分壓為10.2(±5.5)mm Hg，在8%O2中培養(yǎng)時(shí)的平均氧分壓為65.0(±7.5)mm Hg。在常氧(20%O2)中，HSPC培養(yǎng)液的平均氧分壓為157.9(±9.2))mm Hg。為了獲得相對穩(wěn)定的低氧環(huán)境，每隔24小時(shí)，每小時(shí)更換一次大氣，持續(xù)3小時(shí)。在高氧環(huán)境中，HSPC的增殖速度加快。HSPC生長曲線以氧濃度依賴性方式下降，在含有1%O2的環(huán)境中細(xì)胞增殖最低(圖3)。流式細(xì)胞儀分析HSPC DNA含量可用于分析細(xì)胞周期狀態(tài)。這項(xiàng)研究的結(jié)果清楚地表明，當(dāng)環(huán)境中的氧氣濃度降低時(shí)，處于休眠狀態(tài)(如G0)或處于G1期的細(xì)胞數(shù)量顯著增加。在本實(shí)驗(yàn)中，氧濃度似乎對HSPC的凋亡沒有顯著影響(數(shù)據(jù)未顯示)。綜上所述，這些結(jié)果表明，當(dāng)HSPC在模擬體內(nèi)環(huán)境的條件下培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞增殖下降，很可能是由于靜息細(xì)胞(G0)的數(shù)量增加，對細(xì)胞死亡沒有任何顯著影響。本研究證實(shí)了氧濃度對干/祖細(xì)胞表型和功能有一定影響的證據(jù)，并進(jìn)一步證實(shí)了氧在胎盤發(fā)育中起關(guān)鍵作用的觀點(diǎn)。

圖2：在含有低氧(1%或8% O2)和常氧(20% O2)的氧氣環(huán)境中進(jìn)行為期兩天實(shí)驗(yàn)期間，測量的HSPC培養(yǎng)基的實(shí)際氧張力

三、非侵入性氧氣監(jiān)測的新視角

人類胎盤發(fā)育不同時(shí)間點(diǎn)的生理氧濃度可以使用含有1%或8%的O2(5%CO2)兩種不同的混合氣體精準(zhǔn)有效地模擬。本研究中SDR與Presens的OxoDish®配合使用進(jìn)行的測量提供了額外的證據(jù)，證明在大氣氧氣(20%O2)中進(jìn)行的傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)可以創(chuàng)造一個(gè)明顯的高氧環(huán)境，其氧分壓遠(yuǎn)高于人體組織中的正常pO2。在胎盤研究中使用低氧混合氣體與之不同的是以前的研究不包括非侵入性、實(shí)時(shí)的氧氣監(jiān)測。這項(xiàng)調(diào)查清楚地表明，低氧細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的氧濃度處于恒定的流動(dòng)中，很難維持在生理水平。因此，需要對實(shí)驗(yàn)參數(shù)（例如細(xì)胞數(shù)量、培養(yǎng)基成分、氣體置換間隔等）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和廣泛的測試，以確保達(dá)到并隨后維持實(shí)際的生理氧濃度。使用標(biāo)準(zhǔn)化的方案，減少了試驗(yàn)之間的變異性。此外，SDR氧氣監(jiān)測系統(tǒng)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間提供了關(guān)于體外氧氣水平的可靠數(shù)據(jù)。這項(xiàng)研究的重復(fù)性結(jié)果表明，氧濃度、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期狀態(tài)之間存在明顯的聯(lián)系。這些結(jié)果對干細(xì)胞/祖細(xì)胞培養(yǎng)和功能的意義將在未來詳細(xì)研究。SDR為進(jìn)一步的體外研究打開了可能性，在這一研究中，明確的、與生理相關(guān)的氧濃度和穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)條件發(fā)揮著重要作用。此外，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)監(jiān)測和改變介質(zhì)變化或氧氣濃度的變化。使用該系統(tǒng)，可以及時(shí)達(dá)到研究目標(biāo)，從而降低研究成本。

SDR SensorDish®Reader                                            OxoDish®OD24

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