腫瘤細胞在非小細胞肺癌腫瘤微環(huán)境的共培養(yǎng)模型中調節(jié)巨噬細胞表型

鑒于化療和腫瘤蛋白靶向治療在非小細胞肺癌（NSCLC）中的局限性，免疫治療方法已經取得了相當大的進展。然而，免疫檢查點阻斷（ICB）的長期獲益僅發(fā)生在少數(shù)患者中，這表明迫切需要確定免疫抑制的其他機制，包括在腫瘤微環(huán)境（TME）中的機制，這可能會影響免疫治療的療效。巨噬細胞是TME中最豐富的免疫細胞之一，其活性通過多種機制與腫瘤進展有關。在生理和惡性發(fā)育過程中，巨噬細胞存在于“M1 型”促炎、免疫刺激表型和“M2 型”抗炎、血管生成、免疫抑制表型之間。

NSCLC TME中巨噬細胞的類型具有臨床意義，NSCLC基質中M2型巨噬細胞的存在與預后不良有關。例如，抑制巨噬細胞衍生的精氨酸酶-1（Arginase-1，一種抑制T細胞增殖的精氨酸消耗酶）正在臨床前研究和早期臨床試驗中。因此，理解和潛在地靶向產生免疫抑制巨噬細胞表型的潛在機制，特別是那些起源于單個NSCLC的巨噬細胞表型，將是很重要的。不同的NSCLC可能對TME中的巨噬細胞表型產生不同的影響。因此，我們需要一種可獲得且可重復的臨床前模型，該模型可以被操縱來解剖單個NSCLC細胞系如何產生特定的巨噬細胞表型。該模型可以作為研究調節(jié)巨噬細胞表型的治療策略平臺。

來自美國德克薩斯大學西南醫(yī)學中心各處的研究人員曾旨在開發(fā)一種可重復且和生理相關的體外共培養(yǎng)模型，以研究參與巨噬細胞極化的腫瘤細胞和TME因子，并探討可能的治療策略。雖然存在類似的共培養(yǎng)研究，但沒有一項研究詢問了大量具有廣譜分子亞型的患者來源的非小細胞肺癌細胞系對誘導巨噬細胞表型的影響。因此，該團隊建立了一個多細胞共培養(yǎng)模型，包括72株不同患者來源的非小細胞肺癌細胞系、人類腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）和小鼠骨髓來源的巨噬細胞（BMDMs），通過qRT-PCR研究誘導的巨噬細胞表型，并通過定量免疫組織化學在體內使用非小細胞肺癌異種移植物進行驗證，并與癌癥基因組圖譜（TCGA）“匹配”患者腫瘤進行臨床驗證。研究成果發(fā)表在 Journal of Thoracic Oncology 期刊題為“Tumor Cells Modulate Macrophage Phenotype in a Novel In Vitro Co-Culture Model of the NSCLC Tumor Microenvironment”。

實驗建立了小鼠 BMDMs、患者來源的 NSCLC 細胞和患者 CAFs 的多細胞共培養(yǎng)模型，以確定腫瘤細胞對巨噬細胞極化的影響。由于巨噬細胞來源于小鼠骨髓，實驗利用一組小鼠特異性引物對巨噬細胞相關基因（Arginase-1、Il-1β、Socs3、iNos、Il-6、Ym-1）的表達進行qPCR分析，以評估巨噬細胞表型，此外研究了72 株不同的 NSCLC 細胞系和患者來源的 NSCLC CAF 細胞系�？傮w而言，與單獨培養(yǎng)的巨噬細胞相比，大量患者來源的NSCLC 細胞系最常在共培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞中誘導Arginase-1、Il-1β 和 Socs3 表達的增加。

為了表征給定基因的高表達與低表達，實驗將高表達定義為與單獨培養(yǎng)的巨噬細胞的基因表達相比變化≥75倍，將<75倍的變化定義為低表達。通過這種方法，Arginase-1（Arghi），通常與免疫抑制性 M2 樣表型相關，是最常見的誘導表型，其次是Il-1β和Socs3。因此實驗進一步研究了Arghi和Arglow 細胞群的臨床病理和分子特征，以研究可能與共培養(yǎng)巨噬細胞中Arginase-1高表達相關的因素。

定量研究Arghi和Arglow細胞系巨噬細胞基因表達的差異，僅發(fā)現(xiàn)一個巨噬細胞基因 Il-6 在 Arghi 組的表達高于Arglow組。此外對一組15種NSCLC共培養(yǎng)物進行了批量RNAseq以比較qRT-PCR和RNAseq結果，發(fā)現(xiàn)在這個小組中巨噬細胞中 Arginase-1 的高表達與在相同的NSCLC 共培養(yǎng)的RNAseq樣本中觀察到的巨噬細胞表達模式顯著相關。為了進一步研究小鼠巨噬細胞平臺的發(fā)現(xiàn)是否可以在人巨噬細胞重現(xiàn)，使用了單核細胞分化的巨噬細胞與兩種Arghi和Arglow細胞系共培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn) Arghi細胞系類似地將共培養(yǎng)的人巨噬細胞極化為M2樣狀態(tài)。因此，通過這種共培養(yǎng)模型，說明72 株不同的患者來源的 NSCLC 細胞系可重復地（對于每種細胞系模型）在共培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞中誘導差異表達模式，最常見的是免疫抑制性 Arghi表型。

接下來，為了研究Arghi細胞系誘導的巨噬細胞表型是否在體內也能觀察到，實驗建立了Arghi細胞系（5株）和Arglow細胞系（6株）的裸鼠皮下異種移植，以測定宿主小鼠巨噬細胞的表型。結果發(fā)現(xiàn)，與Arglow系構建的NSCLC 異種移植物相比，Arghi系構建的NSCLC異種移植物的總巨噬細胞中位數(shù)密度和Arg1+ 巨噬細胞密度均顯著高于Arglow系。因此，實驗觀察到來自Arghi NSCLC細胞系的異種移植腫瘤在腫瘤基質中具有顯著更高的宿主小鼠Arg1+巨噬細胞密度，為體外研究結果提供了獨立的體內證實。

為了研究臨床樣本中共培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導巨噬細胞表型的外部有效性，實驗研究了患者來源的 NSCLC 細胞系的 RNA 表達和突變數(shù)據，以“匹配”TCGA 數(shù)據庫中具有相似mRNA表達和DNA突變譜的個體患者腫瘤標本。然后，我們利用來自TCGA和CIBERSORT的批量RNAseq表達數(shù)據量化這些臨床標本TME 中的相對 M1 型和 M2 型巨噬細胞。這種方法能夠將NSCLC共培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導的巨噬細胞表型與臨床樣本中M2：M1巨噬細胞的比例相關聯(lián)。

結果發(fā)現(xiàn)，來自任何一種NSCLC細胞系的共培養(yǎng)誘導的巨噬細胞表達模式與分子匹配的TCGA患者腫瘤中發(fā)現(xiàn)的巨噬細胞表型（來自CIBERSORT RNA表達分析）顯著相關。與Arghi NSCLC細胞系匹配的TCGA樣本的M2：M1比值顯著高于與Arglow 細胞系匹配的TCGA樣本。

這些發(fā)現(xiàn)表明，共培養(yǎng)系統(tǒng)中的患者來源的 NSCLC 細胞系誘導巨噬細胞表型，這些表型不僅在體內異種移植物中發(fā)現(xiàn)的相同 NSCLC 細胞系，而且與 TCGA 來源的患者腫瘤標本中發(fā)現(xiàn)的巨噬細胞表型相關，具有相似的 mRNA 和突變譜。這突出表明，實驗中的模型有可能提供一個臨床相關的平臺，從中研究調節(jié)巨噬細胞表型的腫瘤細胞和TME因子。

最后，研究人員探討了NSCLC模型中的臨床病理學或人口統(tǒng)計學因素與誘導巨噬細胞表型之間是否存在任何相關性。迄今為止，尚未對這些因素在多種NSCLC腫瘤或患者來源的細胞系中對巨噬細胞表型的影響進行大規(guī)模研究。令人驚訝的是，沒有一個標準的臨床或分子變量與Arghi或Arglow NSCLC系顯著相關。這些因素包括年齡、性別、種族、吸煙狀況、臨床分期、腫瘤基因型、總突變負荷、組織學亞型和上皮/間充質表型。

在觀察特定的NSCLC腫瘤基因型時，發(fā)現(xiàn)在Arghi或Arglow隊列中，最常見的基因突變是TP53、KRAS、TP53/KRAS、STK11和EGFR，與先前的研究相似。然后，實驗進一步定量研究了肺癌細胞系中巨噬細胞Arginase-1 的表達與關鍵突變腫瘤基因（TP53、KRAS、STK11、KEAP1）的單獨存在或相互組合，沒有發(fā)現(xiàn)任何顯著差異。

鑒于在體外共培養(yǎng)模型中，NSCLC腫瘤基因型與巨噬細胞Arginase-1表達之間沒有顯著相關性，實驗還研究了這些發(fā)現(xiàn)是否在TCGA沉積的臨床NSCLC樣本中也觀察到，結果同樣發(fā)現(xiàn)M2：M1比值在性別、組織學亞型、年齡、總突變負荷或腫瘤基因型方面沒有顯著差異。因此，令人驚訝的是，實驗發(fā)現(xiàn)與巨噬細胞共培養(yǎng)的NSCLC細胞系的臨床病理學、人口統(tǒng)計學和分子學特征與巨噬細胞Arginase-1表達的高誘導或低誘導無關，這些因素也與TCGA數(shù)據集中的巨噬細胞表型無關。
 

圖1 非小細胞肺癌共培養(yǎng)系統(tǒng)誘導巨噬細胞表型研究綜述。

（A）肺癌共培養(yǎng)系統(tǒng)測定。（B） 臨床病理學和人口統(tǒng)計學分析。（C）癌基因型分析和臨床相關性。

總之，該研究中的共培養(yǎng)系統(tǒng)是一個可獲得的、集中的、可重復的NSCLC TME中巨噬細胞活性模型。研究發(fā)現(xiàn)，當與 CAFs 和小鼠巨噬細胞共培養(yǎng)時，大量患者來源的 NSCLC 細胞系最常誘導免疫抑制性 Arginase-1 的高表達，這與主要的臨床、人口統(tǒng)計學和分子腫瘤基因型相關因素無關。這些表型在體內異種移植物中得到概括，并在TCGA沉積的腫瘤數(shù)據集中進一步得到臨床驗證。該共培養(yǎng)模型是早期研究NSCLC TME巨噬細胞生物學的有效工具，也是一個易于使用的系統(tǒng)，可用于研究遺傳表達譜、臨床病理相關性、計劃體內研究的早期驗證，以及篩選可能靶向巨噬細胞活性的新型化合物。因此，該共培養(yǎng)模型是一個強大的、生理一致的平臺，從中可以研究腫瘤細胞和TME的特征以及可能影響巨噬細胞表型的新療法。

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參考文獻：Park JV, Chandra R, Cai L, Ganguly D, Li H, Toombs JE, Girard L, Brekken RA, Minna JD. Tumor Cells Modulate Macrophage Phenotype in a Novel In Vitro Co-Culture Model of the NSCLC Tumor Microenvironment. J Thorac Oncol. 2022 Oct;17(10):1178-1191. doi: 10.1016/j.jtho.2022.06.011. Epub 2022 Jul 5. PMID: 35798240; PMCID: PMC9529910.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35798240/

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