酶標儀準確對焦與良好對準結(jié)果的關(guān)系詳解
用相機或手機拍照的時候，準確對焦是出好片的關(guān)鍵。這一點其實同樣適用于酶標儀中的光學(xué)系統(tǒng)！本文將介紹酶標儀的焦距，以及這項設(shè)置對結(jié)果有何影響。 在酶標儀中，焦距（focal height）是指酶標儀的探測系統(tǒng)與微孔板中樣品之間的距離。最佳對焦位置處于酶標儀能檢測到樣品最高信號強度的平面。如果測量時沒有調(diào)好對焦，會對結(jié)果產(chǎn)生負面影響。
圖1：某酶標儀的焦距曲線
不同型號的酶標儀
之間有何區(qū)別
不同制造商生產(chǎn)的酶標儀功能各異：有些不可調(diào)對焦，有些可能需要手動設(shè)置，有些可以自動調(diào)節(jié)。不能調(diào)節(jié)焦距的儀器通常是入門級設(shè)備，靈敏度有限。手動設(shè)置對焦的儀器需要反復(fù)試驗，根據(jù)經(jīng)驗確定某項測定的最佳焦距。具有自動對焦功能的酶標儀可在測量前自動識別特定樣品或一組樣品的最佳焦距（圖1）。只要加液體積和微孔板類型保持不變，就可以使用上一次測定設(shè)置好的焦距。BMG LABTECH的多功能酶標儀提供自動對焦選項，如CLARIOstar® Plus（圖2），同時也支持根據(jù)需要手動設(shè)置對焦。
圖2：BMG LABTECH的CLARIOstar® Plus提供多種不同的對焦設(shè)置選項
對焦設(shè)置
對信噪比的影響
受液體樣品物理特性的影響，信號強度通常在樣品液面稍下方達到最高。酶標儀會通過識別信號強度最高的平面來確定最佳焦距。提高對焦的高度會使光學(xué)焦點移到液面上方；降低對焦的高度會使光學(xué)焦點向微孔板底部方向移動。 在這兩種情況下，測出的信號強度都會降低，而來自背景噪音的信號則保持不變，這會導(dǎo)致信噪比（圖3）和assay window降低。
圖3：信噪比受對焦設(shè)置的影響
在上圖的例子中，設(shè)置不同焦距測量了100nM熒光團標準樣品和空白樣品，隨后計算出相應(yīng)的信噪比（S/B），并生成相對于焦距的曲線。自動調(diào)節(jié)得出的最佳焦距為9.3mm，對應(yīng)的是本次對比實驗中觀察到的最佳信噪比值。當(dāng)偏離確定的最佳焦距時，信噪比明顯下降。 值得注意的是，不同應(yīng)用的最佳焦距取決于微孔板類型、加液體積和分析類型。比如在測量貼壁細胞樣本時，孔底部的信號強度最高。
對焦設(shè)置對數(shù)據(jù)變異
有何影響？
對焦設(shè)置不僅會影響測出的信號強度，還會影響數(shù)據(jù)變異（圖4），具體來說，設(shè)置不好會使重復(fù)樣品間的差異（%CV）增大，從而降低檢測結(jié)果的質(zhì)量。 
圖4：對焦設(shè)置對數(shù)據(jù)變異的影響
對焦取決于
加液體積
可以看出，準確調(diào)整酶標儀的焦距是獲得最佳結(jié)果的關(guān)鍵，但前提是必須將微孔板上各孔的加液體積差異保持在最小范圍內(nèi)。 由于最佳焦距是根據(jù)一個樣品孔的填充體積確定的，因此，無論是無意中因移液錯誤還是有意中因移液體積不同而造成的差異，都會改變結(jié)果。正如下面的示例（圖5）所展現(xiàn)的，即使各孔之間的體積相差幾微升，也會導(dǎo)致測出信號強度的顯著變化。
圖5：微孔板中不同加液體積對熒光信號的影響
在此示例中，我們在樣品孔中移入了不同體積（10至30μL）的10nM熒光團標準液。在樣品體積為15μL的孔中進行對焦調(diào)節(jié)，之后使用所獲得的設(shè)置對所有樣品進行測量，測量數(shù)據(jù)相對于15μL孔中的數(shù)據(jù)進行歸一化處理。如圖5所示，在加液水平較低或較高的孔上使用15μL的最佳焦距會導(dǎo)致明顯的偏差。即使樣品量只有2.5μL的微小差異，也會導(dǎo)致20%的信號強度偏差。在某些情況下，這甚至?xí)䦟?dǎo)致信號增加，因為樣品體積較高的孔中含有的分析物總量更高。
轉(zhuǎn)載自：BMG LABTECH
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