組織蛋白酶K 參與擾動動脈粥樣硬化依賴于整合素-細胞骨架-NF-κB

血流紊亂引起的動脈粥樣硬化會導致內(nèi)皮功能障礙，激活蛋白酶水平，并調(diào)節(jié)動脈基質成分，引起血管重塑，最終形成動脈粥樣硬化斑塊。血管重塑與彈性蛋白層和膠原基質降解以及細胞外基質 （ECM） 的再分布有關。組織蛋白酶K（CTSK）是肽酶C1家族溶酶體半胱氨酸蛋白酶中最有效的蛋白酶之一，被證實參與動脈粥樣硬化過程中ECM的重新分布。最近，CTSK在人動脈粥樣硬化病變的內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和血管平滑肌細胞中表達。已發(fā)現(xiàn)CTSK受氧化型LDL（OxLDL）、細胞因子和振蕩剪切應力的調(diào)控。然而，血流動力學如何傳遞和調(diào)控CTSK表達的分子機制尚不清楚。

作為生物力學傳感器的重要候選者，整合素在將機械刺激轉化為生化信號方面發(fā)揮著核心作用。整合素聚簇促進β亞基的細胞質尾部與細胞內(nèi)肌動蛋白細胞骨架之間的動態(tài)連接，以形成黏著斑和細胞骨架排列。先前的一項研究發(fā)現(xiàn)整合素αvβ3激活原發(fā)性血流誘導的NF-κB通路，并參與早期動脈粥樣硬化炎癥。

為了探討CTSK調(diào)控擾動流（disturbed flow）誘導動脈粥樣硬化形成的分子機制，華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究室（四川）、生物流變科學與技術教育部重點實驗室（重慶）的聯(lián)合課題組構建了小鼠左頸總局部結扎的方法構建在體擾動流模型，探討擾動流誘導的CTSK參與內(nèi)皮炎癥和血管重塑的機制，檢測了αvβ3整合素和CTSK在動脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)的表達水平及NF-κB的激活情況。研究結果表明，CTSK導致血流依賴性內(nèi)皮炎癥和血管重塑，這有望通過靶向整合素αvβ3-細胞骨架來抑制。該研究對動脈粥樣硬化的治療具有新的啟示意義。相關結果發(fā)表于Genes & Diseases 雜志題為“Cathepsin K contributed to disturbed flow-induced atherosclerosis is dependent on Integrin-actin cytoskeleton-NF-κB pathway”。
 

首先，研究人員利用經(jīng)典的ApoE-/- 小鼠頸動脈部分結扎模型建立了擾動流模型（圖1 A），LCA（左頸動脈）和升主動脈（AA）區(qū)域暴露于擾動流，而RCA（右頸動脈）和降主動脈（DA）區(qū)域暴露于穩(wěn)定的層流。ORO染色和H&E 染色證實，小鼠左頸總血管脂質沉積增多，直徑增大、內(nèi)膜厚度增加以及彈性蛋白層破裂（圖1 B-G）。這些結果表明，擾動流會加速ApoE-/- 小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成。

為了排除血清膽固醇水平和脂質沉積對血管炎癥和重構的影響，實驗使用正常血脂小鼠的部分頸動脈結扎模型進行體內(nèi)擾動流實驗，檢驗了NF-κB負責流動誘導的細胞炎癥的假設。結果在不同流動區(qū)域的ECs中檢測到在NF-κB家族中起關鍵作用的p65，由體內(nèi)層流區(qū)的細胞質易位至 LCA 和 AA 區(qū)域的細胞核中，表明 NF-κB 的激活。qRT-PCR結果顯示，LCA區(qū)域炎癥相關mRNA（IL-1β、IL-6、TNF-α和p65）顯著升高。此外，在正常小鼠中，血流紊亂導致新內(nèi)膜增生而無脂質沉積，彈性蛋白層斷裂增多。這些結果表明，在動脈粥樣硬化形成的開始和進展過程中，擾動流引起的血管炎癥和重塑與血清膽固醇水平或動脈壁中的脂質沉積無關。

圖1 血流紊亂會誘發(fā)左頸動脈（LCA）的動脈粥樣硬化和血管重構。

據(jù)研究，CTSK可能參與了由擾動流引起的血管重塑和血管炎癥。因此，接下來檢測了CTSK和Col1-A在結扎ApoE-/- 小鼠中的分布。結果觀察到 CTSK 和 Col1-A 的共定位，表明 CTSK 可能通過降解 I 型膠原來重塑細胞外基質。21 天后，C57BL/6小鼠在擾動流區(qū)域ECs（LCA，AA）中CTSK表達、蛋白質和mRNA水平均顯著高于層流區(qū)（RCA，DA）的表達。然后研究了在促動脈粥樣硬化區(qū)域擾動流誘導CTSK的分子過程。在前人研究的基礎上，該研究提出將整合素作為擾動流中的機械介質，促進CTSK的表達。因此，實驗使用部分頸動脈結扎模型在 LCA 和彎曲的AA 中創(chuàng)建擾血流。免疫熒光圖像顯示，C57BL/6小鼠結扎21 天后LCA和AA的整合素αv和β3水平顯著高于RCA組和DA組。

此外，采用體外剪切力加載裝置在體外產(chǎn)生單向層流應力（LSS）或擾動剪切應力（DSS），HUVECS暴露于LSS（15 dyn/cm²）或DSS（± 4.5 dyn/cm²）分別持續(xù) 8 小時。與LSS或靜態(tài)對照相比，DSS升高了Ser536位點磷酸化p65的表達水平（圖2 A）。體外研究證實，p65蛋白在DSS誘導的HUVECs中從細胞質轉移到細胞核8小時（圖2 B）。強度曲線顯示，DSS條件下p65蛋白和細胞核具有明顯的共定位性（圖2 B）。由于DSS誘導的p65蛋白磷酸化可促進NF-κB活化并導致細胞炎癥，實驗通過qRT-PCR評估了不同流動條件下HUVECs中促炎mRNA的mRNA表達，與LSS或靜態(tài)對照相比，DSS顯著上調(diào)mRNA（IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8）的定量表達（圖2 C）。

通過Western blot檢測CTSK在暴露于不同流動條件的HUVECs中的表達，結果表明，DSS顯著提高了HUVECs中CTSK的水平（圖2 D），與體內(nèi)模型的結果一致。qRT-PCR結果進一步證實，DSS顯著增強了CTSK的mRNA表達（圖2 E）。I型膠原是CTSK的底物，CTSK可使I型膠原蛋白的三螺旋結構斷裂。在靜態(tài)對照組和LSS組I型膠原纖維明顯突出，而DSS組的CTSK水平高，I型膠原纖維明顯減少（圖2 F）。這些結果表明，DSS可以促進CTSK的表達并降解基質，最終導致血管重塑。此外，發(fā)現(xiàn)DSS組整合素αv和β3的表達明顯高于LSS組或靜態(tài)對照組（圖2 G）。綜上所述，DSS可誘導內(nèi)皮炎癥和ECM再分布，并伴有高水平的CTSK和整合素αvβ3表達。

圖2 DSS 在體外誘導內(nèi)皮炎癥并增加 CTSK 表達。

進一步地，實驗想要闡明整合素如何介導剪切誘導的動脈粥樣硬化變化。上述結果表明，DSS誘導p65，在西侖吉肽（整合素αvβ3的特異性抑制劑）和ATN-161（整合素α5β1抑制劑）存在下，可以重新分布到細胞質，這表明內(nèi)皮炎癥可以通過抑制整合素完全減弱。通過使用西倫吉肽或ATN-161，可以發(fā)現(xiàn)肌動蛋白纖維沒有明顯差異（圖3 A、B）。

qRT-PCR結果顯示，DSS組促炎因子（IL-6、TNF-α、ICAM-1、p65和IL-8）的mRNA表達水平顯著低于預阻斷整合素的LSS組（圖3 C）。相比之下，暴露于LSS通過抑制整合素顯著提高CTSK水平（圖3 D）。采用細胞骨架聚合抑制劑latrunculin B（LatB、10μM、12h）探究不同流動條件下整合素誘導的細胞骨架排列和炎癥反應。抑制細胞骨架排列后，肌動蛋白應激紊亂，板足前緣偽足少且短，血流依賴性內(nèi)皮炎癥增強。

使用 IκB/IKK 抑制劑 BAY 11-7085（10 μM、12h），進一步研究了 NF-κB 對暴露于 DSS 或 LSS 的 HUVECs 中 CTSK 表達的影響，可以發(fā)現(xiàn)，DSS通過抑制NF-κB通路的激活顯著降低了CTSK的表達（圖3 E）。這些結果表明，整合素-細胞骨架介導血流誘導的NF-κB激活和血管重構。

圖3 擾動流誘導內(nèi)皮細胞炎癥，具體取決于整合素-NF-κB軸。

基于上述體外研究結果，細胞表面整合素受體可作為潛在的治療靶點。因此，實驗測試了整合素抑制劑西侖吉肽（5 μg/kg/d）在頸動脈結扎模型中的抗炎作用。結果表明，整合素阻斷可以減輕正常血脂小鼠的炎癥和重塑。

最后實驗評估了整合素阻斷在DSS誘導的加速動脈粥樣硬化中的保護特性。西侖吉肽組頸動脈結扎后高脂血癥小鼠LCA和AA區(qū)域的脂質沉積明顯低于二甲基亞砜對照組（圖4 A、B）。同時，免疫熒光圖像顯示，西侖吉肽給藥后動脈粥樣硬化斑塊中CTSK的表達降低（圖4 C）。此外，還發(fā)現(xiàn)整合素的抑制可以降低CTSK和Col1-A的共定位。H&E染色結果顯示，整合素阻斷可顯著降低結扎后21 天高脂血癥患者動脈粥樣硬化斑塊的進展和血管平均直徑（圖4 D、E）。此外，與二甲基亞砜對照組相比，西侖吉肽組LCA中彈性蛋白的內(nèi)側直徑和破裂次數(shù)均減少（圖4 F-H）。這些結果說明，整合素阻斷可減少擾動流誘導的動脈粥樣硬化。

圖4 整合素阻斷可減少血流紊亂誘發(fā)的動脈粥樣硬化。

總之，該研究的發(fā)現(xiàn)揭示了擾動流導致CTSK表達的增加，并導致內(nèi)皮炎癥和血管重塑，最終導致動脈粥樣硬化，而這取決于整合素 αvβ3-細胞骨架-NF-κB 信號軸。此外，整合素αvβ3-細胞骨架的抑制有望成為血管抗炎和抗動脈粥樣硬化治療的靶點。

參考文獻：Fang F, Feng T, Li J, Zhang H, Wang Q, Chen Y, Wang G, Shen Y, Liu X. Cathepsin K contributed to disturbed flow-induced atherosclerosis is dependent on integrin-actin cytoskeleton-NF-κB pathway. Genes Dis. 2022 Apr 25;10(2):583-595. doi: 10.1016/j.gendis.2022.03.020. PMID: 37223522; PMCID: PMC10201601.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37223522/

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