人脂肪來源干細(xì)胞對間接共培養(yǎng)中隆突性皮膚纖維肉瘤細(xì)胞的影響

脂肪組織來源干細(xì)胞（ADSCs）可以從人皮下脂肪組織中大量提取，因此，它們是干細(xì)胞療法最合適的細(xì)胞來源之一。ADSCs具有多向分化的能力，可以分化為多種細(xì)胞類型，如脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。有報道稱，在熱/化療過程中，裝載生物材料作為抗腫瘤藥物載體的ADSCs可選擇性靶向?qū)嶓w腫瘤。這可以改善典型的藥物遞送方法，與磁共振成像跟蹤診斷應(yīng)用相關(guān)聯(lián)。有趣的是，ADSCs也被證明表現(xiàn)出二元性。這些細(xì)胞不僅極大地促進(jìn)了細(xì)胞再生，而且還促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展。ADSCs在促腫瘤特性上與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）相似，因此，ADSCs在腫瘤微環(huán)境（TME）內(nèi)相互作用，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、活力、侵襲性和化療耐藥性。

盡管關(guān)注ADSCs和腫瘤的研究越來越受到關(guān)注，但這些研究都沒有檢查ADSCs對隆突性皮膚纖維肉瘤（DFSP）的影響。DFSP是一種較為少見的低度惡性軟組織真皮腫瘤，但屬于最常見的皮膚肉瘤之一，起源于真皮內(nèi)纖維組織細(xì)胞，可侵犯皮下組織，一般無包膜。肉瘤的發(fā)病機(jī)制不明確且多種多樣，局部復(fù)發(fā)風(fēng)險高，加上脂肪微環(huán)境（包括ADSCs和相關(guān)生長因子）信號傳導(dǎo)的多變性，應(yīng)進(jìn)行更廣泛的研究。

因此，考慮到脂肪、干細(xì)胞和分離的 ADSCs 在根治性腫瘤切除術(shù)后皮膚和軟組織缺損中的使用越來越多，確定共定位 ADSCs 和 DFSP 細(xì)胞之間的可能相互作用對腫瘤安全性非常重要。不幸的是，關(guān)于這個問題的報告甚少。鑒于此，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整形外科的課題組團(tuán)隊首次進(jìn)行了將原代DFSP細(xì)胞與ADSCs共培養(yǎng)的研究，隨后，量化了增殖、遷移、侵襲和血管生成的變化，并將結(jié)果與DFSP細(xì)胞單一培養(yǎng)的結(jié)果進(jìn)行了比較。此外，研究旨在從基因和蛋白質(zhì)的角度進(jìn)一步了解相互作用，如果ADSCs對DFSP細(xì)胞產(chǎn)生促進(jìn)作用，它可能會提醒整形外科醫(yī)生注意潛在的安全問題，因為這些ADSCs被注射到可能殘留或休眠的DFSP細(xì)胞可以存活和發(fā)展的手術(shù)部位。具體內(nèi)容發(fā)表在 Stem Cell Research & Therapy 期刊題為“Impact of human adipose tissue-derived stem cells on dermatofibrosarcoma protuberans cells in an indirect co-culture: an in vitro study”。

首先，通過成脂、成骨、成軟骨分化實驗檢測ADSCs的多向分化潛能和干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平。結(jié)果表明，從人脂肪組織中分離出的ADSCs表現(xiàn)出典型的ADSCs特征。

然后，采用CCK-8法評估ADSC-CM對DFSP細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，與對照組相比，ADSC-CM在第5天和第7天顯著促進(jìn)DFSP細(xì)胞的增殖。在前3天，實驗組和對照組之間的細(xì)胞增殖率沒有顯著差異。

接下來，實驗評估了ADSCs影響DFSP細(xì)胞遷移的能力。使用細(xì)胞劃痕實驗測試ADSC-CM影響DFSP細(xì)胞遷移的能力，其中DFSP細(xì)胞用ADSC-CM（實驗性）、DMEM/F12 + 10%FBS（陽性對照）或DMEM/F12 SF（陰性對照）處理，結(jié)果表明，與陰性對照（DMEM/F12 SF）相比，ADSC-CM處理在6、12和24 h時顯著促進(jìn)了DFSP細(xì)胞的遷移（分別為1.71倍、2.01倍和3.56倍）。

然后，測試了基底室中ADSCs的存在是否可以誘導(dǎo)比Transwell系統(tǒng)中ADSC-CM產(chǎn)生的更強(qiáng)的反應(yīng)（圖1 B）。使用Transwell系統(tǒng)測試ADSCs對DFSP遷移細(xì)胞計數(shù)的影響，其中DFSP細(xì)胞與ADSCs（實驗）、DMEM/F12+10%FBS（陽性對照）或DMEM/F12 SF（陰性對照）一起孵育（圖1 A）。12 h時，陰性對照組有4.7±1.2個DFSP細(xì)胞遷移，而實驗組有52.5±2.4個細(xì)胞遷移（圖1 C）。24 h時，陰性對照組有6.2±2.2個細(xì)胞出現(xiàn)遷移，而實驗組為38.2±12.6個細(xì)胞（圖1 D）。這些結(jié)果表明，與陰性對照條件（DMEM/F12 SF）相比，ADSCs處理在12和24 h時間點更顯著地促進(jìn)了DFSP細(xì)胞的遷移（分別為11.17倍和6.16倍）。

圖1 通過Transwell測定ADSCs對DFSP細(xì)胞遷移的影響。

（A）通過用結(jié)晶紫染色細(xì)胞來觀察遷移的DFSP細(xì)胞。（B）不同條件下Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)的圖示：將DFSP細(xì)胞接種到上腔室中，將DMEM/F12 + 10%FBS（陽性對照）、DMEM/F12 SF（陰性對照）或ADSC（實驗性）加入下腔室，然后，在12和24小時測定細(xì)胞遷移。12 h（C）和24 h（D）時遷移的細(xì)胞數(shù)。

DFSP細(xì)胞的侵襲性使它們能夠消化Matrigel 基質(zhì)，該基質(zhì)是從Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤小鼠中分離出來的基底膜提取物。使用預(yù)先包被Matrigel 基質(zhì)膠的Transwell系統(tǒng)測試ADSC-CM對DFSP侵襲細(xì)胞計數(shù)的影響，DFSP細(xì)胞用DMEM/F12+10%FBS（陽性對照）、DMEM/F12 SF（陰性對照）或ADSC-CM（實驗性）處理（圖2 A）。36 h時，陰性對照組有0.7±0.8個細(xì)胞侵襲下表面，而實驗組有4.2±1.9個（圖2 C）。這些結(jié)果表明，ADSC-CM處理在36 h時（7倍）比陰性對照組（DMEM/F12 SF）更顯著地促進(jìn)DFSP細(xì)胞的侵襲。

圖2 ADSC-CM 對 DFSP 細(xì)胞侵襲的影響，通過預(yù)包被基質(zhì)膠的 Transwell 測定。
（A）通過結(jié)晶紫染色來觀察侵襲性DFSP細(xì)胞。（B）在不同條件下使用帶有預(yù)包被基質(zhì)膠的Transwell進(jìn)行細(xì)胞侵襲測定的圖示。將DFSP細(xì)胞加入DMEM/F12+10%FBS（陽性對照）、DMEM/F12 SF（陰性對照）或ADSC-CM（實驗）接種到上腔室中，并將DMEM/F12+5%FBS加入下腔室。然后在 36 小時測定細(xì)胞侵襲。（C）36 小時時侵襲細(xì)胞的數(shù)量。

此外，為了評估ADSCs、DFSP細(xì)胞以及共培養(yǎng)的DFSP細(xì)胞和ADSCs分泌的蛋白質(zhì)對血管生成的影響，將HUVECs與不同的CMs（ADSC-CM、DFSP-CM和共培養(yǎng)的DFSP/ADSC-CM）一起孵育，從而形成管狀網(wǎng)絡(luò)。孵育4小時后，實驗觀察到，與對照組（ADSC-CM或DFSP-CM）相比，與DFSP/ADSC-CM共培養(yǎng)的HUVECs形成的管狀網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)孔數(shù)、總管長和總分支長度顯著增加，說明共培養(yǎng)的 DFSP/ADSC-CM增強(qiáng)體外血管生成能力。

最后，使用Transwell系統(tǒng)將ADSCs與DFSP細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，DFSP細(xì)胞中PDGFRB和COL1A1的mRNA水平分別比單培養(yǎng)的DFSP細(xì)胞中的水平增加了1.4倍和1.5倍。48 h后，與單培養(yǎng)的DFSP細(xì)胞相比，共培養(yǎng)細(xì)胞中PDGFRB的蛋白水平適度升高，COL1A1蛋白水平顯著升高。這說明，ADSCs增加了DFSP相關(guān)基因的表達(dá)和蛋白水平。

使用Transwell系統(tǒng)將ADSCs與DFSP細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，DFSP細(xì)胞中促血管生成基因VEGF，HGF和bFGF的mRNA表達(dá)與單一培養(yǎng)的DFSP細(xì)胞相比分別升高1.32倍，1.2倍和1.4倍（圖3 A-C）。48 h后，共培養(yǎng)（實驗組）收集的上清液中VEGF、HGF和bFGF分泌水平顯著高于單培養(yǎng)DFSP細(xì)胞（對照組）。實驗組VEGF濃度為98.0±3.5 pg/mL，對照組為64.2±3.9 pg/mL（圖3 D），實驗組HGF濃度為287.4±14.1 pg/mL，對照組為202.5±12.0 pg/mL（圖3 E），實驗組bFGF濃度為31.6±6.3 pg/mL，對照組為19.6±1.8 pg/mL（圖3 F）。這說明，ADSCs增加了DFSP細(xì)胞中生長因子基因的表達(dá)和共培養(yǎng)的DFSP微環(huán)境中生長因子的分泌。

圖3 ADSCs對DFSP細(xì)胞和微環(huán)境中生長因子基因表達(dá)和蛋白分泌的影響。
單培養(yǎng)組（對照組）或與ADSC共培養(yǎng)（實驗組）的DFSP細(xì)胞中（A）血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、（B）肝細(xì)胞生長因子（HGF）和（C）堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）基因表達(dá)水平。ELISA法檢測DFSP單培養(yǎng)組（對照組）和DFSP-ADSC共培養(yǎng)組（實驗組）上清液48 h的（D）VEGF、（E）HGF、（F）BFGF的分泌水平。

總之，在該研究中，使用體外共培養(yǎng)模型探索了ADSCs和DFSP細(xì)胞之間的相互作用，以了解ADSCs對腫瘤發(fā)展的影響。該報告提供了ADSCs在體外顯著影響DFSP細(xì)胞的多種惡性特征的證據(jù)，例如基因表達(dá)、蛋白質(zhì)分泌、增殖、遷移、侵襲和血管生成。因此，如果在惡性腫瘤細(xì)胞附近給藥，ADSCs可能會大大增加體內(nèi)DFSP腫瘤發(fā)展的風(fēng)險。在討論基于ADSC的療法對DFSP或殘留DFSP細(xì)胞患者的安全性時，需要考慮該研究的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：Yuan Z, Zhu Z, Zhu F, Ding F, Wang Y, Wang X, Luo X, Yang J, Liu F, Sun D. Impact of human adipose tissue-derived stem cells on dermatofibrosarcoma protuberans cells in an indirect co-culture: an in vitro study. Stem Cell Res Ther. 2021 Aug 6;12(1):440. doi: 10.1186/s13287-021-02512-5. PMID: 34362454; PMCID: PMC8344160.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34362454/

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