熒光計算機斷層掃描技術(shù)（FLECT）成像原理及應(yīng)用
導(dǎo)讀
由于精諾真光學(xué)成像的專利保護早已經(jīng)結(jié)束，近幾年市場的光學(xué)成像設(shè)備品牌在增加，尤其是國內(nèi)品牌的增加。生物發(fā)光成像的技術(shù)門檻比較低，這種品牌的增多是有利于終端用戶的，在未來的2-3年，二維光學(xué)技術(shù)為主的設(shè)備市場價格會進一步降低，應(yīng)該接近其合理的價位：80-120萬人民幣，考慮到質(zhì)保年限，3-5年全保的價位應(yīng)該在150萬以內(nèi)，這里的全保是包括CCD的。
但是真正的三維小動物光學(xué)成像設(shè)備，還沒有拉開競爭的序幕。雖然原PE（Revvity）在市場上銷售了不少Spectrum，這僅僅是商業(yè)上的成功，而并非技術(shù)上的進步。三維光學(xué)活體成像的目標是高分辨率、真實定量、全深度、微量檢測、類PET的結(jié)果分析能力。
15年前科學(xué)家已經(jīng)深入研究了影響光學(xué)小動物活體成像結(jié)果的因素[1]，歸納為以下幾點：
1)不同成像設(shè)備的結(jié)果不一致；2）動物操作誤差；3）缺乏組織、疾病和免疫靶向的特異性染料；4）組織對比度；5）皮膚和組織的自發(fā)熒光；6）解剖學(xué)位置與熒光信號配準困難；7）缺乏成像儀器性能規(guī)范和標準；8）研究級別的光學(xué)小動物成像分辨率與臨床設(shè)備不平行；9）高背景光干擾；10）光子在生物組織中的自然散射；11）穿透深度。
本文以下內(nèi)容如果沒有寫明光學(xué)、熒光/生物發(fā)光等，僅針對熒光成像技術(shù)。
一、熒光成像
1、技術(shù)原理
熒光（Fluorescence）是自然界的一種常見發(fā)光現(xiàn)象。當熒光物質(zhì)受到激發(fā)光照射時，內(nèi)部的分子或原子吸收光子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，隨后釋放能量發(fā)出波長更長的發(fā)射光，這種發(fā)射光就是熒光。將熒光物質(zhì)共價結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個基團上[2]，具有無放射物污染、操作簡便、容易觀察等優(yōu)點，可借助熒光特性對被標記對象進行定性、定位以及定量分析。2、熒光發(fā)射計算機斷層掃描成像技術(shù)
熒光發(fā)射計算機斷層掃描(Fluorescence Emission Computed Tomography，F(xiàn)LECT)專利技術(shù)，榮獲科學(xué)雜志評選的“2011年十大創(chuàng)新技術(shù)”之一，是業(yè)界第一臺能夠提供定量熒光三維數(shù)據(jù)的設(shè)備，為臨床前小動物模型的全身成像和體內(nèi)表征提供了無與倫比的檢測能力。如圖2所示，成像時激光直接導(dǎo)入FLECT準直器組件中，激發(fā)小鼠體內(nèi)的熒光。一個由48個光電二極管組成的探測器環(huán)環(huán)繞在小鼠周圍，收集發(fā)出的熒光信號。通過激光光源和探測器圍繞待測動物旋轉(zhuǎn)，可設(shè)置不同層厚進行全角度斷層掃描，從而獲得3D數(shù)據(jù)。采集完成后，所獲取的FLECT數(shù)據(jù)被重建服務(wù)器重建成一個立體圖像，進行三維可視化觀察。
美國TriFoil Imaging開發(fā)了首臺斷層掃描技術(shù)融合的雙模態(tài)影像設(shè)備--InSyTe FLECT/CT。將FLECT和同軸一體的X射線CT斷層掃描成像整合到一個儀器中，提供具有解剖學(xué)參考的分子成像能力。采用其專利的旋轉(zhuǎn)龍門架設(shè)計收集完整角度的動物體內(nèi)的光學(xué)和X射線投影，F(xiàn)LECT類同與PET和SPECT技術(shù)的光學(xué)成像，具有無放射性性，高性價比的優(yōu)勢。探測器旋轉(zhuǎn)360°對熒光信號進行采集，結(jié)合600-900nm之間的近紅外激光光源，熒光斷層掃描技術(shù)重建算法使得熒光在實驗動物體內(nèi)可實現(xiàn)無損耗三維重現(xiàn)，從而獲得動物深層組織的熒光信號，徹底解決了傳統(tǒng)設(shè)備熒光探測深度不夠、二維光斑不能精確定量等問題。
圖2.FLECT技術(shù)原理示意圖二、重建高分辨圖像的能力
InSyTe FLECT/CT系統(tǒng)有兩個重建引擎，一個用于熒光圖像重建，另一個用于CT圖像重建。
1、熒光圖像
熒光圖像重建是將被測物體的表面信息與采集到的熒光數(shù)據(jù)結(jié)合起來，形成熒光源在被測物體中分布的三維表征。將表面信息和熒光數(shù)據(jù)提交至專用的重建服務(wù)器。采用熒光重建專用引擎（FluoroTom），利用輻射傳遞方程和球諧函數(shù)，基于組織中光傳播的正演模型以“有限差分”方法導(dǎo)入傳遞方程�？紤]了組織的光散射、吸收和反射等光學(xué)特性，以及組織結(jié)構(gòu)的影響，模擬光在組織中的傳播路徑、分布和吸收情況，是目前最精確的光學(xué)定量技術(shù)。FLECT能夠提供多角度重建方法和360°三維熒光成像功能，獲取全角度成像三維影像，可從冠狀，矢狀，橫斷觀察感興趣區(qū)域（Region of Interest，ROI），定位光斑位置，生成沿著z軸旋轉(zhuǎn)的動態(tài)最大密度投影動畫（Maximum Intensity Projection，MIP)，并能保存所有深度精準的熒光信號點的三維信息及總含量信息。如圖3所示，F(xiàn)LECT可對熒光信號的反射、散射吸收和校正，在不同的熒光濃度中具有一致的線性(R²=0.9985)，確保了準確性和重復(fù)性。
FLECT可以精確地追蹤熒光信號，將解剖學(xué)位置與熒光信號共配準融合，極大地提高了定位的準確性和數(shù)據(jù)的可靠性。雖然我們的常規(guī)成像設(shè)備在小動物成像上表現(xiàn)出色，但在深層的組織成像中，我們?nèi)悦媾R分辨率不足的問題。如圖4所示，FLECT的分辨率能夠達到1mm3，展現(xiàn)出臨床水平的成像效果。覆蓋大多數(shù)組織的深度，可以達到2.4-4cm的檢測能力，利用先進算法對熒光信號的反射、散射吸收和校正，直接輸出無背景光的圖片，更清晰地觀察到深層的熒光信號，體現(xiàn)了技術(shù)的可靠性和算法的先進性。
圖3.重建濃度與注射濃度擬合曲線
圖4.高分辨率熒光圖像重建
2、CT圖像
利用X線穿透不同密度和厚度組織結(jié)構(gòu)后，發(fā)生不同程度吸收而產(chǎn)生的影像對比，形成不同灰階圖像。高密度組織（如：骨骼），具有較高的衰減系數(shù)，CT上顯示亮；低密度組織（如：肺），具有較低的衰減系數(shù)，CT上顯示暗。
采用COBRA錐形線束算法，真正在軸位旋轉(zhuǎn)掃描時實現(xiàn)三維圖像的采集和重建。使用CT濾光片（鋁、鉬和錫）來增強軟組織對比度并減少束流硬化效應(yīng)，通過去除、降低錐形線束引起的偽影來獲得最佳的CT圖像質(zhì)量。可以對整個ROI或部分ROI區(qū)域的X射線投影進行重建。投影次數(shù)越多，重建時間越長，得到的圖像分辨率越高。
圖5.FLECT/CT骨骼成像效果（可見骨小梁結(jié)構(gòu)）
圖6.FLECT/CT軟組織成像效果（可評估肺結(jié)節(jié)纖維化程度）
3、共配準融合
InSyTe FLECT/CT采用雙滑環(huán)技術(shù)，微型X射線管（激光光源）與高靈敏度探測器一同圍繞攝影對象（小鼠）連續(xù)做斷面掃描。具備多模態(tài)同軸化掃描，可多模態(tài)圖像精準融合。CT成像單元和FLECT成像單元采用同軸化雙模態(tài)設(shè)計，一次性掃描成像，無需重新擺放或移動樣本。避免了多模態(tài)圖像融合的潛在問題：如：融合位置不精確、延遲等。CT系統(tǒng)不僅能提供解剖學(xué)相關(guān)信息，還能改善散射校正，提高光學(xué)成像精度。
圖7.FLECT/CT用于肺靜脈栓塞診斷成像[3]
(應(yīng)用實例[3]：研究團隊開發(fā)了一種特異性熒光探針(Targ-Cy7)，單鏈抗體scFv靶向結(jié)合血栓中活化血小板受體GPIIb/IIIa，用于頸動脈血栓、肺靜脈栓塞體內(nèi)成像。）
三、深層組織檢測能力
1、生物組織對光線的吸收
在700-900nm這段近紅外區(qū)域內(nèi)，存在一個“光譜窗”(Spectral Window)。在這個“光譜窗”內(nèi)，生物組織對光線的吸收作用大大降低，光線可以進入更深一些的組織。同時，由于血紅蛋白和細胞色素含氧量不同導(dǎo)致的吸收光譜的差異仍然可以分辨。當波長大于900nm時，組織中的水成分對光子的吸收作用十分強烈，光子進入組織數(shù)毫米就會被吸收殆盡。而在低于700nm的可見光范圍內(nèi)，血紅蛋白對光線的吸收作用大大增加，同時，組織的散射作用也十分厲害[4]。因此，在醫(yī)學(xué)研究中通常使用波長位于光譜窗內(nèi)的近紅外光作為探測光源。FLECT采用被稱作“醫(yī)學(xué)光譜之窗”的介于600-900nm之間的近紅外光，如圖8所示，利用該波段光譜低自發(fā)熒光、低組織吸收以及良好的組織穿透能力等優(yōu)點。該波段熒光染料具備全身、深部組織斷層成像所需的最佳特性。
2、激發(fā)熒光的光源
FLECT采用激光作為激發(fā)光，對熒光源的激發(fā)效率較高，遠遠優(yōu)于寬帶光源，安裝在超低反射率、0.1Na準直器中進行聚焦，覆蓋動物周圍360度，使得激光光束能夠穿透組織較深的部位，在接收器上生成清晰而集中的圖像。如圖9所示它的熒光檢測器是由48個高靈敏度、低噪聲的硅光電二極管組成的探測器環(huán)（量子效率＞85% @ 500-900 nm），掃描時每一層的每一個角度都被采集48次，通過算法的優(yōu)化和校正，得到的數(shù)據(jù)更準確。
四、活體內(nèi)三維定位能力
在光學(xué)活體成像中，理想情況下，信號與靶標的實際位置能夠100%的重合。然而，倘若檢測到的信號發(fā)生偏移，導(dǎo)致錯誤定位，那么這種情況相較于沒有信號，實則更加糟糕！我們注意到，二維成像的熒光強度受拍照角度的限制和檢測深度的限制，如果對小鼠的正面、背面、側(cè)面不同方向的熒光成像，它的熒光強度和位置是不一致的。此外，受背景光的干擾，不得不解剖小鼠，離體成像得到結(jié)果，不僅增加了實驗的復(fù)雜性和難度，也限制了一些實驗方案的設(shè)計，其原因主要包括光學(xué)特性和成像設(shè)備的檢測方法等。從光學(xué)特性角度來看，當光子從組織表面某處進入組織，并以一個固定的速度傳輸。這個速度取決于該介質(zhì)的光折射率(即光速(mm/sec)=3.0×1011/n，n是該介質(zhì)中的折射率)。光子在傳輸過程中會發(fā)生兩種情況：一種情況是光子在某個傳播位置上被組織內(nèi)的載色體吸收而停止繼續(xù)傳播；另一種情況是光子遇到一個可以被看成散射源的粒子，這時就會發(fā)生隨機性的彈性碰撞(即只改變其傳輸方向而速度保持不變)。光子由于彈性碰撞改變了飛行方向，并沿著這個方向繼續(xù)傳播，而后此光子或被吸收或再次發(fā)生散射。這個過程不斷進行，直到光子被吸收或逸出介質(zhì)[4]。
從光學(xué)成像設(shè)備的檢測方法來看，現(xiàn)有的光學(xué)成像系統(tǒng)借助單個檢測器通過反射（a）或透射（b）方式，實現(xiàn)探針在樣本體內(nèi)成像。在反射成像時，激發(fā)光（輸入）照射樣本表面，然后收集來自樣本同一表面發(fā)出的熒光（輸出）。透射光是從檢測器的相反方向照射樣本，因此光傳播路徑是穿透樣本的。這兩種方法都存在明顯弊端：反射法僅能從動物體表面收集到準確的數(shù)據(jù)；而透射法由于使用單個檢測器，使得整個樣本的成像質(zhì)量并不統(tǒng)一，輸出側(cè)的靈敏度和分辨率都要高于輸入側(cè)[6]。
FLECT技術(shù)是從樣本的全方位角度進行激發(fā)并精確測量發(fā)射光子，避免了局部斷層成像方案中出現(xiàn)的扭曲失真和偽影情況。因為激發(fā)光和熒光發(fā)射光是要透過動物樣本這個散射介質(zhì)，光的散射會影響分辨率和定量結(jié)果。FLECT先進的重建算法已將這些因素考慮在內(nèi)，通過在動物樣本實際體積內(nèi)建立3D分布模型并使用精確的光在組織中傳播模型來解決這些問題。這種方法與以前的方法相比少了很多的假定，從而提高了成像性能。
圖10光學(xué)成像系統(tǒng)檢測方法[5]
圖11.FLECT/CT用于腫瘤靶向探針多模態(tài)成像[7]
應(yīng)用實例[7]：研究團隊利用熒光染料Cy7和放射性Cu64，雙標記轉(zhuǎn)鐵蛋白包裹的納米探針（64Cu-GdF3@Tf-Cy7 NPs）上，能夠進行PET和光學(xué)成像。探針會靶向結(jié)合到腫瘤上，如果腫瘤發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，會先被前哨淋巴結(jié)中的巨噬細胞吞噬，前哨淋巴結(jié)出現(xiàn)熒光。作用利用CT、PET/CT、FLECT/CT三種成像結(jié)果，可視化原發(fā)腫瘤是經(jīng)前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的。
五、熒光絕對定量能力
隨著市場上各種熒光標記試劑盒的出現(xiàn)、分子探針以及報告基因轉(zhuǎn)染的進展，熒光成像變得更加容易，并且可以在大多數(shù)實驗室進行。傳統(tǒng)上，二維光學(xué)成像在高通量篩選中有著典型的應(yīng)用，而三維光學(xué)成像則被用于定量研究。二維光學(xué)成像在探測生物發(fā)光和表面熒光信號、篩選“是/否”定性方面非常有效；然而，由于生物組織對可見光和近紅外（NIR）波段光的非線性衰減，隨著熒光源深度的增加，數(shù)據(jù)變得更加不確定性和不可靠。二維光學(xué)成像由于缺乏深度信息而產(chǎn)生數(shù)據(jù)采集缺失，同時缺乏解釋光子的算法理論問題。例如，腎部成像時，動物應(yīng)處于俯臥位，肝/膀胱顯像時，動物應(yīng)處于仰臥位。研究人員必須手動改變動物的位置，從不同角度觀察它，這就是二維熒光成像的所謂“位置敏感”問題。
FLECT同時獲取透射信號和反射的全角度信號。利用CT采集的數(shù)據(jù)進行基于對比度的分割，將光學(xué)數(shù)據(jù)應(yīng)用于CT選擇的指定區(qū)域，并執(zhí)行重建。在動物周圍360°采集信號，因此，F(xiàn)LECT克服了“位置敏感”問題。FLECT是目前最精確的光學(xué)定量技術(shù)，此突破性的光學(xué)成像性能助力研究人員產(chǎn)出真正前所未有的實驗成果，實現(xiàn)熒光信號的絕對量化。
1、不同深度的定量結(jié)果
利用光學(xué)特性的圓柱形模擬假體（µa = 0.1 cm-1, µs’=10 cm-1），距表面12 mm和5 mm的深度含有2個直徑為3 mm的內(nèi)腔，用于模擬淺表層和深層的檢測深度。通過將倍比稀釋后的，不同濃度的熒光染料填充到假體進行掃描，建立濃度-熒光強度的標準曲線（1-13 μM）。FLECT/CT的定量結(jié)果：R2（@5 mm）=0.9814；R2（@12 mm）=0.9921
圖12.不同深度的定量結(jié)果
圖13.測試用假體與小鼠體內(nèi)熒光強度擬合曲線
2、不同方向的定量結(jié)果
將不同濃度的ICG熒光染料（1.25μM、2.5μM、5μM、10μM）填充到假體進行掃描，建立濃度-熒光強度的標準曲線。注射已知濃度（2.5μM）ICG，調(diào)整假體方向，進行成像并計算濃度。
如圖14所示，FLECT/CT的定量結(jié)果：R2（@12 mm）=0.9964，檢測濃度是2.2μM；不僅準確定位到假體中的熒光信號，而且不同角度的成像結(jié)果是一致的；說明FLECT采用360°檢測熒光信號，成像結(jié)果不受檢測方向的影響，克服了位置敏感性的問題。
結(jié)論
綜上所述，熒光發(fā)射計算機斷層掃描技術(shù)（FLECT）克服了已有熒光成像的局限，解決熒光在動物體內(nèi)的精準三維定位、檢測深度、高分辨率圖像、定量實驗，實現(xiàn)功能成像與結(jié)構(gòu)成像兩種方法學(xué)的結(jié)合，為科研工作者提供了更為準確、高效的臨床前研究工具。
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