熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方法和應(yīng)用介紹

        實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。

       在常做的QPCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

在Real-timePCR中，模板定量有兩種策略，相對(duì)定量和絕對(duì)定量。
 
         相對(duì)定量是用于測(cè)定兩個(gè)或多個(gè)不同樣品中靶基因量的差異，得到的數(shù)據(jù)是目的基因在各樣本中含量的相對(duì)比例。即將實(shí)驗(yàn)樣本中靶基因的Ct值與對(duì)照樣本的Ct值進(jìn)行比較，結(jié)果用實(shí)驗(yàn)樣本中靶基因量與對(duì)照樣本中靶基因量的比值或差異倍數(shù)來表示。該方法在qPCR定量檢測(cè)RNA水平中最常見，研究生理變化對(duì)基因表達(dá)水平的影響。

        絕對(duì)定量常用于精確計(jì)算初始模板中目的基因的濃度，比如測(cè)定血液樣品中病毒顆粒數(shù)（DNA或RNA）,細(xì)胞中基因的拷貝數(shù)等，得到的數(shù)據(jù)是單個(gè)樣本的定量描述，不依賴于其他樣本。理想情況下，Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，這種關(guān)系表現(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)曲線，絕對(duì)定量的檢測(cè)即根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行的定量。



一、實(shí)驗(yàn)方法
1.RNA提取
（1）目前最常用的RNA提取方法就是trizol法，具有極強(qiáng)的裂解能力，可以在短時(shí)間內(nèi)充分裂解細(xì)胞或者組織樣本，保持RNA的完整性，有效抑制RNA的降解；目前市面上還有很多成品的常用RNA提取試劑盒，均是如此原理。
2.具體步驟
（1）拿出凍存組織或者新鮮組織，稱重，充分液氮研磨；
（2）加入1ml trizol或者其他成品裂解液，充分混勻后放置震蕩搖勻上5-10min，使樣本充分裂解；
（3）4℃，13000rpm離心5min后，吸取上清轉(zhuǎn)移至新1.5ml離心管中；
（4）加入預(yù)冷氯仿后，迅速劇烈震蕩30s-60s，靜置5-10min后，4℃離心；
（5）此時(shí)離心管中液體分為三層，吸取最上層水溶液轉(zhuǎn)移新離心管中；
（6）加入等體積異丙醇，充分混勻后，靜置5-10min后，4℃離心；
（7）棄上清，對(duì)管底白色沉淀加入預(yù)冷75%乙醇，混勻清洗后，4℃離心，棄上清；
（8）吹干沉淀后，加入DEPC水溶液，測(cè)濃度，-80攝氏度保存。
3.RNA濃度測(cè)量
一般使用nanodrop就可以測(cè)量，觀察260/280在1.8-2即可；此外也可以進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)明顯拖帶RNA可能降解；
4.反轉(zhuǎn)錄
（1）RNA自身是無法作為PCR反應(yīng)的模板的，需要先將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在進(jìn)行QPCR檢測(cè)；
（2）通常根據(jù)RNA濃度，每個(gè)樣本量取固定3ug/5ug的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加入反轉(zhuǎn)錄試劑盒中配套的試劑，在固定溫度進(jìn)行；得到的cDNA稀釋同倍數(shù)后，-80℃保存。
5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)
（1）常規(guī)認(rèn)為相同RNA的量進(jìn)行的反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA不需要調(diào)整濃度，在上機(jī)檢測(cè)PCR時(shí)取相同體積cDNA進(jìn)行，一般取2-4ul均可。



（2）如果是做絕對(duì)定量，則上述需要增加標(biāo)準(zhǔn)品即可；如果是做常規(guī)mRNA，內(nèi)參插管選擇actin或者GAPDH即可；若檢測(cè)的是特殊的micRNA等，內(nèi)參常規(guī)使用U6。
（3）常見案例