Nature解讀：Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)助力揭開(kāi)mRNA識(shí)別和包裝之謎

真核生物的基因表達(dá)需要成熟的mRNA從細(xì)胞核選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行翻譯。新生成的mRNA被加工和包裝成核糖核蛋白復(fù)合物(mRNPs)后，通過(guò)必需轉(zhuǎn)錄輸出復(fù)合物(TREX)識(shí)別輸出。然而，mRNP識(shí)別和三維組織的機(jī)制尚不清楚。

近日，維也納生物中心分子病理學(xué)研究所在Nature (IF: 69.504)雜志上發(fā)表了名為mRNA recognition and packaging by the human transcription-export complex的研究。研究報(bào)道了重組和內(nèi)源性TREX – mRNA結(jié)構(gòu)，并提出了核mRNA識(shí)別和包裝的機(jī)制。
 

1 冷凍電鏡分析
TREX通過(guò)其ALYREF亞基多價(jià)作用于mRNA結(jié)合的EJC（外顯子連接復(fù)合體）。為了解其相互作用機(jī)制，作者重組了一系列不同RNA長(zhǎng)度(15或50個(gè)核苷酸) 的ALYREFN-EJC-RNA多聚體復(fù)合物。ALYREF截?cái)鄬?shí)驗(yàn)顯示，ALYREF (55-182) (殘基55-182) 是ALYREF - EJC – RNA有效重構(gòu)和多聚的必要條件。ALYREF (55-182)-EJC-RNA復(fù)合物的多聚合依賴于蛋白-蛋白接觸。作者隨后純化分析了此復(fù)合物六聚體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。
 

圖1b. ALYREF55-182–EJC–RNA復(fù)合體冷凍電鏡分析（俯視圖和側(cè)視圖）

ALYREF-EJC-RNA復(fù)合體結(jié)構(gòu)
ALYREF (55-182)-EJC-RNA的每個(gè)原聚體提供一個(gè)EJC – EJC（圖1b左）和三個(gè)ALYREF - EJC接口（擴(kuò)展圖2h），通過(guò)保守的ALYREF –EJC多價(jià)作用（擴(kuò)展圖2i），連接成一個(gè)環(huán)。為維持這種結(jié)構(gòu)，ALYREF WxHD(界面b) 或RRM結(jié)構(gòu)域(界面c和d) 突變，防止體外ALYREF - EJC - RNA復(fù)合物的形成和多聚。
 

擴(kuò)展圖2h. ALYREF - EJC接口：ALYREF WxHD(界面b) 及RRM結(jié)構(gòu)域(界面c和d) ；i. ALYREF、EIF4A3和MAGOH中ALYREF - ejc界面殘基多序列比對(duì)

該結(jié)構(gòu)中，一個(gè)ALYREF分子橋接三個(gè)EJC-RNA復(fù)合物。兩個(gè)EJC分別連接mRNA兩端，ALYREF結(jié)合后使兩個(gè)EJC靠近及mRNP壓實(shí)。此外，ALYREF結(jié)合域1、2（RBD1和RBD2）結(jié)構(gòu)域中富含Arg - Gly的保守基元是體外結(jié)合RNA所必需的。

綜上，ALYREF-和EJC介導(dǎo)的mRNP識(shí)別和包裝可能依賴于多價(jià)蛋白和蛋白- mRNA的相互作用。

ALYREF 將 mRNP橋接到 THO–UAP56
冷凍電鏡結(jié)果顯示(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2h)，只有ALYREF WxHD和RRM區(qū)域接觸EJC-RNA復(fù)合物。因此，ALYREF將EJC-RNA復(fù)合物與THO - UAP56的橋接，可能是通過(guò)其保守的多拷貝UAP56結(jié)合基(UBMs)實(shí)現(xiàn)。ALYREF-RNA結(jié)合活性包含在RBD1和RBD2結(jié)構(gòu)域中。RNA過(guò)濾結(jié)合親和力試驗(yàn)表明，RBD1和RBD2可能有助于RNA傳遞到UAP56，但對(duì)其與ALYREF55-182的結(jié)合無(wú)效。實(shí)驗(yàn)采用Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)檢測(cè)RNA的標(biāo)記熒光信號(hào)（488nm，Azure Biosystems），GraphPad Prism函數(shù)擬合計(jì)算親和力。

核提取物和體外生化數(shù)據(jù)支持這一模型。數(shù)據(jù)表明，ALYREF和THO的多價(jià)相互作用可能對(duì)TREX在mRNPs上的組裝以及UAP56向mRNA的有效遞送很重要。

進(jìn)一步結(jié)構(gòu)分析顯示，只有結(jié)合了mRNA的EJC才能形成多價(jià)ALYREF-EJC復(fù)合物，這表明mRNA前剪接可能先于mRNP包裝。

2 TREX-mRNP結(jié)構(gòu)與接觸

TREX-mRNP多價(jià)模型
作者隨后對(duì)TREX-mRNP進(jìn)行體外交聯(lián)及冷凍電鏡分析，與其天然配合物對(duì)比顯示：體外重建的ALYREF - EJC相互作用也發(fā)生在天然配合物中。此外，本研究確定了CBC內(nèi)以及EJC EIF4A3亞基與PSAP復(fù)合物亞基PININ之間的交聯(lián)，可與各種輸出適配器協(xié)同作用，并導(dǎo)致多價(jià)TREX-mRNP組裝。

TREX–mRNP 冷凍斷層掃描密度與冷凍電鏡結(jié)構(gòu)非常吻合。

TREX復(fù)合物包被在mRNP表面
TREX復(fù)合物僅在mRNP表面結(jié)合，其四個(gè)UAP56亞基面向mRNP(圖4a, b)。但綜合分析表明，TREX復(fù)合物與mRNP相互獨(dú)立關(guān)聯(lián)，這可能是TREX適應(yīng)mRNP形狀和大小多樣性所必需的。作者預(yù)測(cè)，2到3個(gè)TREX復(fù)合物可同時(shí)結(jié)合到平均含3500個(gè)mRNA核苷酸的人類mRNP上。
 

圖4a. 降噪后TREX - mRNP冷凍電鏡層析圖；b. 含有兩個(gè)TREX復(fù)合物的TREX - mRNPs圖

mRNP形成致密小球
mRNPs形成致密的球體，表面的TREX復(fù)合物發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，內(nèi)部蛋白（如SRSF家族蛋白）則發(fā)揮組織作用。

為比較研究TREX - mRNP結(jié)構(gòu)中TREX及mRNP的環(huán)境親和力，作者建立了如下實(shí)驗(yàn)：使用CRISPR-Cas9敲入系統(tǒng)，獲得GFP-THOC5及GFP-EIF4A3 的K562細(xì)胞系（THOC5為T(mén)REX亞基；EIF4A3為EJC亞基），將核提取物與攜帶熒光蛋白 AF647 的抗GFP納米體孵育。將混合物梯度超離心后，使用Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行成像（GFP和AF647熒光通道檢測(cè)），檢測(cè)納米體對(duì)不同GFP融合蛋白組分的親和力（重梯度組分為T(mén)REX-mRNPs GFP融合蛋白；輕梯度組分為游離的GFP-THOC5及GFP-EIF4A3蛋白）。結(jié)果顯示(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10b,c)，納米體與GFP-THOC5在所有組分都能很好地結(jié)合；相反，納米體在重梯度組分中與GFP-EIF4A3結(jié)合較差�？梢�(jiàn)，TREX - mRNP結(jié)構(gòu)中TREX的環(huán)境親和力強(qiáng)于mRNP。

此外，所有內(nèi)源性標(biāo)記的GFP-THOC5或慢病毒過(guò)表達(dá)的THOC1-GFP核提取物，均可被抗GFP納米體免疫沉淀，而GFP-EIF4A3的反應(yīng)效率則很低(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10e)。Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)檢測(cè)。這些數(shù)據(jù)均支持觀察到的TREX-mRNP結(jié)構(gòu)。
 

擴(kuò)展圖10a. 探測(cè)mRNP復(fù)合物中蛋白質(zhì)可及性的實(shí)驗(yàn)示意圖；b. 核提取物GFP-THOC5在不同梯度組分中的SDS-PAGE熒光信號(hào)；c.核提取物GFP-EIF4A3在不同梯度組分中的SDS-PAGE熒光信號(hào)；e. Western blot顯示THOC1-GFP (異位過(guò)表達(dá); Lenti O/E) ， GFP-THOC5(內(nèi)源性標(biāo)記; endo) 及GFPEIF4A3(內(nèi)源性標(biāo)記)的消耗速率（圖b,c,d,e為Sapphire激光掃描成像系統(tǒng)拍攝）；f. GFP標(biāo)記的THOC5或EIF4A3在TREX-mRNPs中可及性模型。

3 mRNA包裝和輸出模型
我們的研究結(jié)果提出了一個(gè)TREX依賴的核mRNA包裝和跨mRNA尺度輸出的模型(圖5)。
 

圖5. mRNA包裝模型

其中，TREX可能通過(guò)四種機(jī)制促進(jìn)mRNA的生物發(fā)生：

一、TREX的包被在空間上限制mRNP。THO28、41和ALYREF53與UAP56的聯(lián)合多價(jià)結(jié)合可能共同刺激UAP56的ATP酶活性，調(diào)節(jié)隨后的mRNP重塑和mRNA輸出因子加載(圖5) 。二、在TREX-mRNP結(jié)構(gòu)中，THO復(fù)合物位于mRNP表面，利于在核輸出之前從mRNP中釋放。三、核內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)錄可避免有害的RNA-DNA相互作用或mRNP成熟過(guò)程中RNA-RNA接觸。反之，TREX缺陷導(dǎo)致DNA附近松散mRNA的積累，將造成基因組不穩(wěn)定。四、TREX包被可以解釋mRNPs如何免受核mRNA降解機(jī)制的影響。

成熟的mRNP具有與TREX類似的球狀結(jié)構(gòu)，可更有效地通過(guò)擁擠的核質(zhì)和核孔復(fù)合物，mRNA輸出因子在其中被裝載到mRNP表面，使其通過(guò)核孔復(fù)合物的疏水屏障進(jìn)行運(yùn)輸。

4 總結(jié)與討論
核mRNP的識(shí)別包裝依賴于特異性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和非特異性蛋白質(zhì)- mRNA的相互作用，這可以解釋如何在不區(qū)分長(zhǎng)度和序列不同的mRNA的情況下鑒定成熟的mRNA。mRNP獨(dú)特的球狀分子結(jié)構(gòu)，對(duì)調(diào)節(jié)核mRNA的表達(dá)，維持核漿中mRNA的流動(dòng)性，并促進(jìn)mRNA核輸出具有重要意義。

原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41586-023-05904-0#Sec84

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