巨噬與腫瘤細胞之間串擾通過CXCL5/PI3K/AKT/mTOR通路抵抗胃癌化療

胃癌是最普遍的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。盡管手術(shù)前后聯(lián)合化療已被證明可以提高患者的生存率，但化療抵抗（chemoresistance）的發(fā)生仍然是獲得有效化療的主要障礙。5-FU（五氟尿嘧啶）仍然是胃癌的一線化療藥物，但化療抵抗往往出現(xiàn)導致臨床結(jié)果不理想。因此，更好地了解5-FU耐藥的分子機制對于改善胃癌的臨床結(jié)果至關(guān)重要。

研究表明，腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境（TME）其他成分之間的串擾促進了化療抵抗的發(fā)展。腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）構(gòu)成TME中的主要免疫細胞，TAMs分泌多種細胞因子和趨化因子進入TME，這些小蛋白是重要的調(diào)節(jié)劑，可以促進治療耐藥性的發(fā)展。TAMs分泌的CCL2被揭示可激活乳腺癌細胞中的PI3K/AKT/mTOR通路，從而誘導乳腺癌對他莫昔芬治療的耐藥性。TAMs通過EMT程序調(diào)節(jié)5-FU介導的結(jié)直腸癌化療耐藥性，并通過釋放CCL22調(diào)節(jié)caspase-介導的細胞凋亡�；�于上述研究現(xiàn)狀，可以推測TAMs分泌的細胞因子或趨化因子可能促進胃癌化療抵抗的發(fā)展。

基于此，北京協(xié)和醫(yī)院普通外科、病理科課題組的一項研究曾探討了TAMs與胃癌細胞化療抵抗表型之間的相互作用。實驗首先研究了CD68（TAMs標志物）在接受基于5-FU的新輔助化療的胃癌患者胃癌組織中的臨床價值，并闡明了TAMs浸潤與胃癌對化療抵抗之間的相關(guān)性，此外還鑒定了一種特異性趨化因子CXCL5并進一步研究了其潛在的分子機制與疾病預后的相關(guān)性。該研究結(jié)果揭示了TAMs與胃癌細胞之間的相互作用，提高了對TAMs如何促進胃癌化療抵抗的認識，并可能為化療抵抗性胃癌患者提供一種新的治療策略。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 Cancer Cell International 期刊題為“Crosstalk between tumor-associated macrophages and tumor cells promotes chemoresistance via CXCL5/PI3K/AKT/mTOR pathway in gastric cancer”。
 

首先，為了研究巨噬細胞在胃癌中的生物分布，實驗通過免疫組化檢測了接受 5-FU 新輔助化療患者臨床樣本中巨噬細胞標志物之一 CD68 的表達。結(jié)果顯示，與病理組相比，無病理反應組組織中浸潤的巨噬細胞數(shù)量顯著增加。這表明，巨噬細胞浸潤可能在胃癌化療抵抗的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。

然后通過將親本細胞連續(xù)暴露于濃度遞增的 5-FU 來建立兩種 5-FU-抵抗性胃細胞系 MKN45-R 和 HGC27-R。CCK-8 測定證實了5-FU以劑量依賴性方式降低細胞活力。此外，化療抵抗性相關(guān)蛋白P-gp和抗凋亡蛋白Bcl-2顯著升高，促凋亡蛋白Bax顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，細胞通過長期 5-FU 的誘導獲得化學抵抗性。

接著將人單核細胞系THP-1分化為巨噬細胞（M0），隨后分別與MKN45-R、HGC27-R細胞及其親本細胞以非接觸式共培養(yǎng)48小時，獲得來自5-FU-敏感性TME（MS）和5-FU抵抗性TME（MR）的TAMs（圖1 A），采用RT-qPCR分析共培養(yǎng)胃細胞對M0細胞的影響。結(jié)果顯示，MS和MR細胞中CD86、TNF-α和IL-12等M1相關(guān)基因表達水平相對于M0細胞下調(diào)，且MR細胞的表達水平顯著低于MS細胞（圖1 B、C）。相比之下，CD163、CD206、IL-10、Arg-1和VEGF-A等M2相關(guān)基因表達水平上調(diào)，且MR細胞的表達水平明顯高于MS細胞（圖1 B、C）。此外，流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，MS和MR細胞中M1巨噬細胞的百分比降低，M2巨噬細胞百分比增加（圖1 D）。這些結(jié)果表明，胃癌細胞可以調(diào)節(jié)巨噬細胞向M2樣極化，而化療抵抗細胞似乎更有效地誘導巨噬細胞極化為M2表型。

圖1 共培養(yǎng)的胃癌細胞誘導巨噬細胞極化為 M2 表型。

接下來，將胃癌細胞與不同表型的巨噬細胞在非接觸式共培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)48小時，然后清除巨噬細胞并收集胃癌細胞進行進一步分析（圖2 A），采用CCK-8法檢測巨噬細胞對5-FU耐藥性的影響。結(jié)果表明，與MS和MR巨噬細胞共培養(yǎng)使HGC27-S細胞和MKN45-S 細胞的IC50值均增強（圖2 B、C）。此外，共培養(yǎng)MR巨噬細胞顯著促進胃癌細胞對5-FU的抵抗性，而MS巨噬細胞的作用明顯小于MR巨噬細胞（圖2 D、E）。

然后通過流式細胞術(shù)檢測化療誘導的細胞凋亡。結(jié)果表明，與單獨培養(yǎng)或與MS巨噬細胞共培養(yǎng)的胃癌細胞相比，與MR巨噬細胞共培養(yǎng)的胃癌細胞的凋亡率顯著降低（圖2 F、G）。Western blot分析進一步表明，在與MR巨噬細胞共培養(yǎng)的胃癌細胞中，P-gp和Bcl-2的表達水平顯著升高，Bax顯著降低（圖2 H、I）。這些結(jié)果表明，5-FU-抵抗性胃癌細胞可以有效地誘導巨噬細胞極化為M2表型，這反過來又促進胃癌細胞的5-FU-抵抗性。

圖2 共培養(yǎng)M2極化的巨噬細胞增強胃癌細胞5- Fu抵抗性。

進一步地，研究人員推測MS和MR巨噬細胞增強胃癌細胞5-FU抵抗能力的不同可能是由于分泌的細胞因子水平不同，因此選取11種細胞因子進行了RT-qPCR分析，發(fā)現(xiàn)只有CCL18和CXCL5的轉(zhuǎn)錄水平與以往結(jié)果的趨勢一致。與CCL18相比，MS和MR巨噬細胞中的CXCL5水平非常高，因此重點關(guān)注CXCL5，以驗證其在胃癌細胞5-FU耐藥中的作用。將5-FU-敏感性胃癌細胞在存在rhCXCL5或CXCL5中和抗體下單獨培養(yǎng)或與MR巨噬細胞共培養(yǎng)48小時，然后用不同濃度的5-FU處理24小時評估細胞存活率。CCK-8實驗所示，共培養(yǎng)MR巨噬細胞或添加rhCXCL5可誘導5-FU耐藥，而CXCL5中和抗體可降低胃癌細胞中MR巨噬細胞介導的對5-FU的耐藥性。上述結(jié)果表明，來源于M2極化巨噬細胞的CXCL5是胃癌細胞中與5-FU抵抗性相關(guān)的主要趨化因子之一。

越來越多的證據(jù)表明，對細胞凋亡的抵抗是導致化療抵抗的原因。5-FU主要通過介導腫瘤細胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，實驗想要確定 M2 極化巨噬細胞是否通過調(diào)節(jié)胃癌細胞凋亡介導 5-FU-抵抗性。結(jié)果表明，共培養(yǎng)MR巨噬細胞或rhCXCL5都可以降低凋亡比例，然而應用CXCL5中和抗體會降低MR巨噬細胞介導的胃癌細胞凋亡抵抗力（圖3 A、B）。Western blot分析進一步表明，共培養(yǎng)MR巨噬細胞或添加rhCXCL5可增加Bcl-2的表達，降低Bax的表達，而CXCL5中和抗體可顯著減弱這種效應（圖3 C、D）。既往研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號通路通過調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和化療抵抗在腫瘤進展中起關(guān)鍵作用�；�于此，進一步研究了M2極化巨噬細胞對PI3K/AKT/mTOR通路激活的潛在影響，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)MR巨噬細胞和rhCXCL5均能顯著提高磷酸化的PI3K、AKT和mTOR的表達，而CXCL5中和抗體處理顯著減弱這種激活該信號通路的能力。這些數(shù)據(jù)表明，M2極化巨噬細胞來源的CXCL5可抑制細胞凋亡，激活PI3K/AKT/mTOR通路，增加胃癌細胞5-FU-抵抗性。

圖3 M2極化的巨噬細胞通過激活胃癌細胞CXCL5/PI3K/AKT/mTOR通路抑制細胞凋亡，增加5-Fu耐藥性。

最后，為了確定巨噬細胞如何影響胃癌中單核細胞的募集，進行了趨化性測定，發(fā)現(xiàn)MR巨噬細胞的趨化誘導作用明顯強于M0和MS巨噬細胞，CXCL5中和抗體可減弱MR巨噬細胞誘導的胃癌趨化作用。采用免疫組化法檢測患者臨床標本中CXCL5、CD163和CD206的表達，觀察到CXCL5的高表達與CD163陽性巨噬細胞和CD206陽性巨噬細胞的高浸潤相關(guān)。基于上述數(shù)據(jù)，可以推測胃癌細胞，尤其是化療抵抗細胞可以誘導巨噬細胞極化為 M2 表型，從而導致 CXCL5 分泌增加。高水平的CXCL5可以反過來募集單核細胞形成更多的M2極化巨噬細胞，進一步促進胃癌化療抵抗微環(huán)境的發(fā)展。

然后通過免疫組化法檢測患者臨床樣本中CXCL5的表達水平分析CXCL5在胃癌患者預后的臨床相關(guān)性。CXCL5低表達和高表達的代表性圖像如圖4所示。此外，CXCL5高表達患者的總生存率（OS）顯著低于CXCL5低表達患者（圖4 B）。上述結(jié)果表明，CXCL5可作為預測胃癌化療抵抗和預后的有效生物標志物。

圖4 CXCL5在胃癌組織中的高表達與患者的不良預后相關(guān)。（C）顯示巨噬細胞如何與胃癌細胞相互作用以促進胃癌化療抵抗微環(huán)境發(fā)展的圖形摘要。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)化療抵抗的胃癌細胞更有效地誘導巨噬細胞極化為M2表型，進而反過來促進胃癌細胞的化療抵抗性，從而在TAMs和胃癌細胞之間形成正反饋回路（圖4 C）。TAMs衍生的CXCL5在細胞間相互作用中起著關(guān)鍵作用。CXCL5可以募集單核細胞形成更多的M2極化巨噬細胞，并通過激活胃癌PI3K/AKT/mTOR通路進一步促進化療抵抗的發(fā)展。這些發(fā)現(xiàn)表明，靶向TAMs并阻斷TAMs與胃癌細胞之間的細胞間串擾可能代表了化療抵抗性胃癌患者的潛在治療策略。

參考文獻：Su P, Jiang L, Zhang Y, Yu T, Kang W, Liu Y, Yu J. Crosstalk between tumor-associated macrophages and tumor cells promotes chemoresistance via CXCL5/PI3K/AKT/mTOR pathway in gastric cancer. Cancer Cell Int. 2022 Sep 23;22(1):290. doi: 10.1186/s12935-022-02717-5. PMID: 36151545; PMCID: PMC9508748.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36151545/

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