利用NIR-Ⅱ比率熒光探針精確監(jiān)測前哨淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀態(tài)

本文要點(diǎn)：前哨淋巴結(jié)（SLN）是原發(fā)腫瘤引流區(qū)域淋巴結(jié)中的特殊淋巴結(jié)，是原發(fā)腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移所必經(jīng)的第一批淋巴結(jié)，轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞離開腫瘤后最有可能集中在SLN。前庭淋巴結(jié)切除術(shù)（SLNE）是腫瘤外科治療和術(shù)后活檢診斷轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，使用的技術(shù)包括傳統(tǒng)的藍(lán)色染料法、核素探測法以及新興的熒光探測法。目前侵襲性SLNE的診斷不準(zhǔn)確，術(shù)后活檢耗時(shí)，增加了患者本可避免的疼痛和潛在的死亡率。術(shù)中準(zhǔn)確檢測SLN的轉(zhuǎn)移狀態(tài)并指導(dǎo)轉(zhuǎn)移性SLN的完全切除，以抑制不必要的SLN清掃引起的并發(fā)癥，是迫切需要解決的問題。

 

 

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本文報(bào)道了一個(gè)基于雙示蹤劑的NIR-II比率熒光納米平臺(tái)，結(jié)合了靶向和非靶向部分，可通過記錄比率信號(hào)來確定SLN通過血管和淋巴向遠(yuǎn)端的轉(zhuǎn)移狀態(tài)，并可視化淋巴網(wǎng)絡(luò)伴隨腫瘤生長的詳細(xì)變化。與臨床可用的最先進(jìn)的NIR造影劑相比，本研究中的雙示蹤劑的NIR-II比率熒光探針性能顯著改進(jìn)，為快速評(píng)估淋巴功能并指導(dǎo)癌癥手術(shù)期間腫瘤浸潤性SLN的去除提供了有力工具。

圖1. NIR-II比率熒光探針應(yīng)用示意圖

 

在作者以往的工作中報(bào)道了一對(duì)比率納米顆粒NaYF4:Nd@NaYF4（腫瘤靶向性）和NaErF4@NaYF4（無靶向性），分別在1060 nm處和1525 nm處顯示出強(qiáng)烈的發(fā)射，在1500 nm處具有最高的信背比（SBR），顯著地優(yōu)于目前臨床應(yīng)用的ICG和IR-800CW，并領(lǐng)先于作者先前研發(fā)的PbS@CdS量子點(diǎn)。在小鼠足部注射后可以精確可視化病變淋巴結(jié)（LN）的形態(tài)學(xué)變化，并準(zhǔn)確地繪制LN與周圍組織之間的邊界。

圖2. 比率探針實(shí)現(xiàn)清晰、高分辨的NIR-II熒光成像

 

而要實(shí)現(xiàn)對(duì)SLN的持續(xù)監(jiān)測，還要求探針必須具有長期的LN保留以及良好的穩(wěn)定性。作者在正常小鼠中對(duì)4種熒光分子分別進(jìn)行累積行為和光穩(wěn)定性測試，發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)和比例探針都表現(xiàn)出長期的LN保留，成像窗口可達(dá)約168小時(shí)；比例探針不僅在連續(xù)激發(fā)下表現(xiàn)出顯著的穩(wěn)定性，而且消除了區(qū)域熒光信號(hào)減弱引起的背景干擾�？梢娫摫嚷侍结樋梢蕴峁┳銐虻臅r(shí)間窗口來收集有用的信息并完成手術(shù)程序。

圖3. 近紅外熒光團(tuán)體內(nèi)成像質(zhì)量和光穩(wěn)定性比較

 

腫瘤附近的淋巴結(jié)可分為正常、炎癥和轉(zhuǎn)移期3種。目前依賴于SLN大小區(qū)分的成像探針靈敏度較低，因?yàn)檗D(zhuǎn)移性和炎癥性SLN形態(tài)變化差異較小。而利用比率探針，通過在小鼠足墊注射4T1細(xì)胞建立后肢腫瘤模型，記錄1000-1100nm和1500 nm窗口內(nèi)的熒光信號(hào)并計(jì)算熒光比，可以分辨SLN中是否存在轉(zhuǎn)移性腫瘤。作者觀察到，荷瘤小鼠中來自NaYF4:Nd@NaYF4的信號(hào)明顯強(qiáng)于NaErF4@NaYF4的信號(hào)，而在正常小鼠中則沒有這種差異，與切除LN離體成像所得到的結(jié)果一致。

探針注射后30分鐘的信號(hào)采集便足以診斷腫瘤轉(zhuǎn)移性LN，而比率探針的長保留時(shí)間為檢測和手術(shù)提供了足夠長的成像窗口。調(diào)整可變焦透鏡還可以實(shí)現(xiàn)區(qū)域放大圖像，不僅揭示了LN的形態(tài)大小與轉(zhuǎn)移狀態(tài)之間的關(guān)系，同時(shí)還有助于更有效地切除病變淋巴結(jié)。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了比率探針作為快速轉(zhuǎn)移鑒別造影劑具有足夠的可靠性和獨(dú)特的優(yōu)勢。

圖4. 腫瘤引流LN的可視化檢測

 

延長對(duì)SLN的監(jiān)測時(shí)間，可以觀察到SLN的轉(zhuǎn)移狀態(tài)，同時(shí)使炎癥性SLN和轉(zhuǎn)移期SLN的分辨更加清晰。小鼠腫瘤模型建立后14d內(nèi)，僅能觀察到SLN大小增加，比率信號(hào)卻與陰性組相差無幾；28d以后可見SLN大小進(jìn)一步增加的同時(shí)比率信號(hào)顯著增強(qiáng)。由此可見：腫瘤在早期僅使SLN發(fā)生炎癥，并不向其轉(zhuǎn)移；而隨著腫瘤發(fā)展，SLN將逐漸被遷移的腫瘤細(xì)胞浸潤。這一發(fā)現(xiàn)被炎癥因子（IL-6）免疫組化和H&E染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)。

 

 

作者通過在腫瘤中直接注射比率探針，嘗試直接評(píng)估后肢周圍與腫瘤生長平行的淋巴管網(wǎng)絡(luò)的變化。在NIR-Ⅱ熒光下可見原發(fā)腫瘤周圍的淋巴管數(shù)量逐漸增加，淋巴管網(wǎng)絡(luò)隨著腫瘤的生長而不斷變化。

一般來說，腹股溝淋巴結(jié)與足部淋巴結(jié)通過淋巴管相連，即使不能呈現(xiàn)出比率型信號(hào)，也可被從腫瘤注射的探針照亮。但作者意外發(fā)現(xiàn)，僅在腫瘤生長的第28天和第40天，比例探針才能照亮腹股溝淋巴結(jié)。這意味著早期腫瘤可能使小鼠淋巴管受損，但隨著腫瘤進(jìn)展，淋巴管又重定向到腹股溝淋巴結(jié)，從而導(dǎo)致腹股溝淋巴結(jié)也被腫瘤細(xì)胞浸潤。這一意想不到的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明比率探針作為檢測平臺(tái)的足夠可靠性和靈敏度，具有現(xiàn)有探針無法實(shí)現(xiàn)的高對(duì)比淋巴管網(wǎng)絡(luò)成像能力和精確識(shí)別SLN轉(zhuǎn)移狀態(tài)的功能。

圖6. 比率探針鑒別腫瘤細(xì)胞引流LNs的可靠性

 

前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的診斷對(duì)于規(guī)劃癌癥治療的個(gè)性化治療程序至關(guān)重要。將成像擴(kuò)展到更長的窗口可以消除自發(fā)熒光/散射干擾，并且所選NIR-II熒光團(tuán)的長時(shí)間保留和優(yōu)異的光穩(wěn)定性優(yōu)于NIR-I熒光團(tuán)，用于活體內(nèi)LNs成像。與僅提供LNs成像能力的量子點(diǎn)相比，多功能比例熒光探針可以同時(shí)作為生物傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)生理過程變化的高分辨率監(jiān)測。比率熒光探針通過有效腫瘤細(xì)胞靶向能力，有助于通過SLNs的成像大小和比率值來區(qū)分腫瘤細(xì)胞侵襲和發(fā)炎的SLN。這些結(jié)果表明，基于比率熒光成像的策略可以靈敏、無創(chuàng)地識(shí)別/確定SLNs的轉(zhuǎn)移狀態(tài)，并排除無腫瘤SLNs，從而減少不必要的手術(shù)侵襲。

 

參考文獻(xiàn)

Li M, Sun B, Zheng X, Ma S, Zhu S, Zhang S, Wang X. NIR-II Ratiometric Fluorescence Probes Enable Precise Determination of the Metastatic Status of Sentinel Lymph Nodes. ACS Sens. 2024 Feb 21.

 

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