InnoScan在環(huán)境藍(lán)細(xì)菌高通量檢測(cè)微陣列芯片的應(yīng)用

InnoScan文獻(xiàn)快訊—
環(huán)境藍(lán)細(xì)菌高通量檢測(cè)微陣列芯片
 
   
摘要：環(huán)境藍(lán)細(xì)菌因其在生態(tài)系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用而備受關(guān)注。 中國研究團(tuán)隊(duì)近期開發(fā)了一種名為 CyanoStrainChip 的新型DNA 微陣列芯片，可對(duì)環(huán)境藍(lán)細(xì)菌進(jìn)行菌株水平的全面分析。 通過 43,666個(gè)全基因組、菌株特異性探針涵蓋幾乎所有藍(lán)細(xì)菌主要類群。 使用CyanoStrainChip無需培養(yǎng)藍(lán)細(xì)菌，與傳統(tǒng)方法相比成本更低，計(jì)算要求更低，定量效果更好。
   
 
 
      藍(lán)細(xì)菌代表一個(gè)廣泛而普遍存在的光合自養(yǎng)原核生物門，以其非凡的遺傳多樣性而聞名。這些微生物存在于幾乎所有環(huán)境中，并在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，不僅是地球大氣氧氣的重要貢獻(xiàn)者，還是次生代謝產(chǎn)物的多產(chǎn)者。在某些情況下，藍(lán)細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致有害的水華，釋放毒素進(jìn)入淡水和海洋環(huán)境，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能，以及用于娛樂、飲用水、漁業(yè)和人類健康的水質(zhì)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。事實(shí)上，在各種生態(tài)系統(tǒng)中對(duì)藍(lán)細(xì)菌多樣性和豐度進(jìn)行分析將對(duì)生態(tài)研究和有害藻華監(jiān)測(cè)、評(píng)估和管理至關(guān)重要。
      然而，當(dāng)前研究普遍忽視了藍(lán)細(xì)菌種內(nèi)多樣性，導(dǎo)致在種或以上的概括性結(jié)論，并未考慮菌株差異的可能性。許多屬于同一藍(lán)細(xì)菌屬（或種）的多個(gè)分離株比較研究，如 Raphidiopsis、Planktothrix 和 Microcystis，證明它們?cè)谛螒B(tài)、生理、毒素和遺傳學(xué)方面存在相當(dāng)大的種內(nèi)多樣性。但是目前環(huán)境藍(lán)細(xì)菌的高通量檢測(cè)方法很難達(dá)到菌株水平�；�于聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) 的靶向標(biāo)記基因DNA 測(cè)序是克服藍(lán)細(xì)菌多樣性評(píng)估中表型表征局限性，最廣泛使用的技術(shù)。早在1997年，就開發(fā)出了一組用于特異性擴(kuò)增藍(lán)細(xì)菌16S rRNA基因片段的寡核苷酸引物。然而，這些基于PCR的測(cè)序方法無法在物種或以下進(jìn)行鑒定，因?yàn)镈NA片段只有幾百個(gè)核苷酸長，其分辨率受到限制。過去十年來，對(duì)環(huán)境樣本核酸進(jìn)行直接宏基因組測(cè)序已成為探索復(fù)雜環(huán)境微生物群落組成的有力工具。雖然通過生物信息學(xué)工具（如 inStrain 和 PStrain）可成功識(shí)別群落中的菌株，但仍然存在一定的局限性。鑒于環(huán)境樣品的高復(fù)雜性，通常需要足夠的序列深度來提高靈敏度和特異性，這也意味著巨大的測(cè)序和計(jì)算成本，這對(duì)許多研究人員來說仍然不可負(fù)擔(dān)。此外，技術(shù)重現(xiàn)性低，并且在宏基因組分析中準(zhǔn)確量化密切相關(guān)菌株的相對(duì)豐度存在困難，可能會(huì)引入顯著偏差。因此，需要一種新方法來解決現(xiàn)有方法的這些缺點(diǎn)。
      DNA微陣列最初由數(shù)萬個(gè)DNA片段排列在載玻璃片上，以進(jìn)行基因表達(dá)分析。從那時(shí)起，各種類型的DNA微陣列已被開發(fā)用于不同環(huán)境中的微生物檢測(cè)，包括功能和分類分析。與基于測(cè)序的方法相比，微陣列具有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)，包括高重復(fù)性、可靠的定量、相對(duì)可負(fù)擔(dān)的成本和易于使用。鑒于高密度微陣列技術(shù)的成熟和藍(lán)細(xì)菌基因組數(shù)據(jù)的快速積累，近期中國一研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了 CyanoStrainChip，這是一種DNA微陣列芯片，用于環(huán)境藍(lán)細(xì)菌的高通量和高分辨率分類鑒定。該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了43,666個(gè)全基因組菌株特異性探針，用于靶向1277株藍(lán)細(xì)菌。通過體外模擬群落和野外樣品檢查該芯片的實(shí)用性和局限性。結(jié)果表明，該微陣列芯片能夠在復(fù)雜環(huán)境中準(zhǔn)確地在菌種水平檢測(cè)藍(lán)細(xì)菌。
   
      CyanoStrainChip目標(biāo)藍(lán)細(xì)菌菌株按主要類群呈現(xiàn)。藍(lán)細(xì)菌主要群體的分支關(guān)系，基于先前研究的系統(tǒng)發(fā)育分析，利用了834個(gè)藍(lán)細(xì)菌特異性通用單拷貝同源基因基準(zhǔn)。
該芯片設(shè)計(jì)，一共使用了約2500個(gè)藍(lán)細(xì)菌基因組來設(shè)計(jì)特異性探針，其中包括163個(gè)基因組，這些基因組在該研究團(tuán)隊(duì)之前的出版物中已測(cè)序，以及約2300個(gè)來自NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫的基因組。為了減少數(shù)據(jù)集的冗余，采用FastANI來生成整個(gè)基因組的相似性計(jì)算指標(biāo)，并將所有基因組在99%相似性閾值下聚類成菌株。對(duì)于每個(gè)菌株簇，保留一個(gè)代表性基因組進(jìn)行下游分析�？偣�，有1277個(gè)基因組保留下來，包括458個(gè)純培養(yǎng)基因組、556個(gè)單一擴(kuò)增基因組和263個(gè)宏基因組組裝基因組。
      采用基于k-mer的方法來發(fā)現(xiàn)菌株特異性寡核苷酸，根據(jù)寡核苷酸的各種性質(zhì)（包括探針雜交自由能、熔解溫度、探針次級(jí)結(jié)構(gòu)、特異性和復(fù)雜性）對(duì)候選探針進(jìn)行過濾。對(duì)于每個(gè)菌株，如果剩余探針足夠多，則選擇30-40個(gè)特異性探針；否則，保留所有剩余探針。選擇的探針被提交到Agilent eArray 5.0程序進(jìn)行微陣列定制（客制CGH，8×64K平臺(tái)）。
CyanoStrainChip數(shù)據(jù)的預(yù)處理。在InnoScan 900掃描儀（該型號(hào)現(xiàn)已更新為InnoScan 910）   上掃描的微陣列tiff圖像通過Agilent Feature Extraction（AFE）軟件處理，以生成樣品點(diǎn)原始強(qiáng)度和一系列統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。在進(jìn)行下游分析之前，采取幾個(gè)微陣列數(shù)據(jù)預(yù)處理步驟來抵消系統(tǒng)性變化并過濾假陽性。
     
 
 
 
文獻(xiàn)原文鏈接：  https://doi.org/10.1021/acs.est.3c11096