超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡實(shí)時(shí)成像研究膜蛋白的形成過程和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制
應(yīng)用案例（超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡-HS-AFM）：“眼見為實(shí)”超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡實(shí)時(shí)成像研究膜蛋白的形成過程和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制
翻譯整理：北京佰司特科技有限責(zé)任公司
超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡（High-Speed Atomic Force Microscope，HS-AFM）由日本 Kanazawa 大學(xué) Prof. Ando 教授團(tuán)隊(duì)研發(fā)，日本RIBM公司（生體分子計(jì)測研究所株式會(huì)社，Research Institute of Biomolecule Metrology Co., Ltd）商業(yè)化的產(chǎn)品，可以達(dá)到視頻級(jí)成像的商業(yè)化原子力顯微鏡。HS-AFM突破了傳統(tǒng)原子力顯微鏡“掃描成像速慢”的限制，能夠在液體環(huán)境下超快速動(dòng)態(tài)成像，分辨率為納米水平。樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動(dòng)態(tài)觀測。超高速視頻級(jí)原子力顯微鏡HS-AFM主要有兩種型號(hào)，SS-NEX樣品掃描（Sample-Scanning HS-AFM）以及PS-NEX探針掃描（Probe-Scanning HS-AFM）。推出至今，全球已有100多位用戶，發(fā)表 SCI 文章 300 余篇，包括Science, Nature, Cell 等頂級(jí)雜志。翻譯整理：北京佰司特科技有限責(zé)任公司
相較于目前市場上的原子力顯微鏡成像設(shè)備，HS-AFM突破了 “掃描成像速慢”的限制，掃描速度高可達(dá) 20 frame/s，并且有 4 種掃描臺(tái)可供選擇。樣品無需特殊固定染色，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動(dòng)態(tài)觀測。液體環(huán)境下直接檢測，超快速動(dòng)態(tài)成像，分辨率為納米水平。探針小，適用于生物樣品；懸臂探針共振頻率高，彈簧系數(shù)小，避免了對(duì)生物樣品等的損傷。懸臂探針可自動(dòng)漂移校準(zhǔn)，適用于長時(shí)間觀測。采用動(dòng)態(tài)PID控制，高速掃描時(shí)仍可獲得清晰的圖像。XY軸分辨率2nm；Z軸分辨率0.5nm。
HS-AFM不僅擁有超高掃描速率與原子級(jí)別分辨率，而且具有操作的簡易性，使得對(duì)單分子動(dòng)態(tài)過程的捕捉變得十分方便，為科研工作者研所和理解生物物理、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、病毒學(xué)以及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的單分子動(dòng)態(tài)過程提供了一款強(qiáng)大的工具。
全新的HS-AFM采用了新的高頻微懸臂架構(gòu)，更低噪音、更高穩(wěn)定性的2控制器，高速掃描器，緩沖防震設(shè)計(jì)，主動(dòng)阻尼，動(dòng)態(tài)PID，驅(qū)動(dòng)算法優(yōu)化，多種前沿技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)在超高速下獲取高分辨的生物樣品信息。新系統(tǒng)整合了基于工作流程的操作軟件，直觀的用戶界面與流程化、自動(dòng)化的設(shè)置使得研究人員可以專注于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，不需要復(fù)雜的操作和條件設(shè)置，快速獲取數(shù)據(jù)，加速研究的產(chǎn)出。
1）膜蛋白的結(jié)構(gòu)形成過程研究
成孔毒素（Pore-forming toxin, PFT）能在靶細(xì)胞膜上寡聚化形成穿膜通道, 破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并使其滲透性增強(qiáng)而導(dǎo)致細(xì)胞滲透性溶解。 PFT寡聚體在細(xì)胞膜上可以連接形成密排六方結(jié)構(gòu)（hcp）。
Lysenin是來源于蚯蚓的一種PFT，可在鞘磷脂/膽固醇（SM/chol）雙層膜結(jié)構(gòu)中寡聚化并形成hcp。實(shí)驗(yàn)中，研究人員使用了日本RIBM的超高速視頻原子力顯微鏡（HS-AFM），對(duì)SM/chol雙層膜結(jié)構(gòu)中l(wèi)ysenin寡聚體組裝成hcp的動(dòng)態(tài)過程進(jìn)行了實(shí)時(shí)成像，發(fā)現(xiàn)了hcp結(jié)構(gòu)形成的規(guī)律。
研究人員將lysenin與SM/chol雙層膜結(jié)構(gòu)在云母為基底的環(huán)境下共同培養(yǎng)后使用HS-AFM進(jìn)行成像。下圖顯示了lysenin寡聚體形成的hcp在膜結(jié)構(gòu)上的分布。白色六邊形表示一個(gè)hcp單元，箭頭表示未完全形成的寡聚體。通過計(jì)算可以獲得Hcp單元的間距和寡聚體直徑等數(shù)據(jù)，與之前使用電鏡的研究獲得的數(shù)據(jù)一致。
通過HS-AFM還可以獲得lysenin寡聚體的三維圖像。對(duì)各個(gè)寡聚體的高度數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，可以發(fā)現(xiàn)高度分布主要為兩種，高度較低的寡聚體已經(jīng)嵌入了膜結(jié)構(gòu)中，并可能形成了核孔。
接下來研究人員對(duì)400×300nm區(qū)域內(nèi)的SM/chol雙層膜結(jié)構(gòu)上的lysenin組裝過程進(jìn)行了動(dòng)態(tài)成像。圖A展示了lysenin簇的形成并可以檢測簇的增長方向（圖B），終組裝形成hcp結(jié)構(gòu)。
在黑色的云母基底上也能觀察到lysenin，分析雙層膜結(jié)構(gòu)上和基底上的lysenin半徑大小可以得出，雙層膜結(jié)構(gòu)上的lysenin形成了寡聚體進(jìn)而組成hcp結(jié)構(gòu)，而基底上的lysenin處于單體或不規(guī)則聚集形態(tài)，無法形成寡聚體，這也與之前的研究結(jié)果一致。
對(duì)視野內(nèi)的lysenin簇如B圖進(jìn)行劃分并進(jìn)一步分析可以得出：
1. Lysenin形成單個(gè)簇后，在雙層膜上水平擴(kuò)散，聚集排列形成hcp結(jié)構(gòu)；
2. 新形成的簇會(huì)組成新的矩形排列（彩色矩形）或填充到已有的矩形排列的空缺處，有些已經(jīng)形成的簇會(huì)在膜上擴(kuò)散或分解；
3. 矩形排列的方向可變（如上方紅色矩形）；
4. 絕大多數(shù)Lysenin簇在裝配開始就會(huì)聚集形成簇，而不是隨機(jī)分布在膜上。
HS-AFM還可以在更高的放大倍數(shù)下以更高速率成像，以實(shí)現(xiàn)對(duì)lysenin簇組裝成hcp結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)進(jìn)行更詳細(xì)的檢測。
通過對(duì)結(jié)果的分析可以得出，大部分從外圍結(jié)合到hcp結(jié)構(gòu)區(qū)域的簇會(huì)以平均0.45秒的時(shí)間分解，而已經(jīng)形成hcp結(jié)構(gòu)的則相對(duì)更加穩(wěn)定，可能原因是內(nèi)部的lysenin寡聚體相互之間具有更多的結(jié)合位點(diǎn)，更難以分解。
小結(jié)：高速AFM成像可用于lysenin形成hcp結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)過程的研究。lysenin簇于膜上形成，經(jīng)過大量的分解\重組和擴(kuò)散形成hcp結(jié)構(gòu)，隨著膜上hcp數(shù)量的增多而趨向于穩(wěn)定。同時(shí)，我們還可以獲得簇的高度信息，用于表征lysenin與膜的結(jié)合以及穿膜通道的形成。
2）膜蛋白的結(jié)構(gòu)形成機(jī)制研究
膜聯(lián)蛋白（Annexin）是于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)普遍存在的一種蛋白，與多種細(xì)胞膜功能相關(guān)，如胞吞、胞吐以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)等。膜聯(lián)蛋白在鈣離子環(huán)境下可結(jié)合至磷脂，進(jìn)行細(xì)胞膜修復(fù)等作用，但至今對(duì)于膜聯(lián)蛋白-鈣離子-磷脂三者的組裝與分解的動(dòng)態(tài)過程的研究仍處于空白。
這項(xiàng)研究中，研究人員使用日本RIBM的超高速視頻原子力顯微鏡（HS-AFM）引導(dǎo)了膜聯(lián)蛋白V（A5）的組裝與分解并進(jìn)行成像，分析了過程中的蛋白結(jié)構(gòu)，動(dòng)力學(xué)和分子間相互作用。
研究人員先將雙層脂膜加入含2mM鈣離子的緩沖液，再加入A5并用HS-AFM成像�？梢杂^察到A5三聚體在膜上形成了六邊形晶格結(jié)構(gòu)（標(biāo)記1），并在中間含有縱向高度更低的三聚體（標(biāo)記2）或者空洞（標(biāo)記3），這與先前使用其他AFM和電鏡的結(jié)果相一致。
HS-AFM可以進(jìn)行每秒幾十幀的更高速度的成像。對(duì)上圖中標(biāo)記2的區(qū)域進(jìn)行高速成像，三聚體依然保持了相似的尺寸和高度。在高速成像下，研究人員次發(fā)現(xiàn)三聚體的方向會(huì)發(fā)生變化：向上（0°）和向下（60°）。此A5三聚體與其他形成了六邊形晶格結(jié)構(gòu)的三聚體相比，分子間相互作用更弱，使其能夠改變方向。
傳統(tǒng)的AFM和電鏡獲得的圖像是時(shí)間或空間的平均圖像，無法記錄短時(shí)間內(nèi)的變化，因此難以發(fā)現(xiàn)三聚體方向的改變。通過HS-AFM的高速實(shí)時(shí)成像才發(fā)現(xiàn)并捕捉到了這一現(xiàn)象。
HS-AFM還可以與微流系統(tǒng)和激光等其他儀器結(jié)合，在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)樣品和環(huán)境進(jìn)行更多操作并實(shí)時(shí)成像，可以對(duì)兩種A5三聚體的組裝與分解進(jìn)行更加深入、詳細(xì)的研究。
研究人員使用微流系統(tǒng)可向?qū)嶒?yàn)環(huán)境加入EDTA,可以降低鈣離子含量，使三聚體形成的晶格結(jié)構(gòu)分解，同時(shí)，通過控制的流量可以地計(jì)算出加入EDTA的含量進(jìn)行定量分析；整合的高精度紫外激光，可以對(duì)鈣離子籠鎖化合物進(jìn)行解籠鎖操作，使其在實(shí)驗(yàn)過程中可以多次反復(fù)釋放鈣離子。
起初，我們可以清晰地觀察到晶格結(jié)構(gòu)；277s時(shí)緩慢加入40mM EDTA后，晶格結(jié)構(gòu)分解；441s時(shí)啟動(dòng)紫外激光，解籠鎖發(fā)生釋放出鈣離子，晶格結(jié)構(gòu)重新組裝；870s時(shí)關(guān)閉激光，晶格結(jié)構(gòu)再次開始分解。
進(jìn)一步提高放大倍數(shù)后進(jìn)行高分辨率成像，可以發(fā)現(xiàn)加入EDTA后，非六邊形晶格的A5三聚體相對(duì)于形成了六邊形晶格結(jié)構(gòu)的三聚體分解更快，對(duì)于鈣離子含量下降更加敏感。
小結(jié)：通過HS-AFM的高速、高分辨率成像以及與其他儀器的聯(lián)用，在體外構(gòu)建了實(shí)時(shí)生化反應(yīng)環(huán)境，在對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)直接成像的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)了構(gòu)成膜聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)的兩種不同狀態(tài)的蛋白三聚體的差異，同時(shí)證明了鈣離子在蛋白組裝過程中的必要性。
3）膜蛋白的跨膜運(yùn)動(dòng)機(jī)制研究
谷氨酸鹽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GltPh）的主要作用是通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸鹽，將突觸間隙的谷氨酸鹽濃度保持在興奮性毒性以下，防止神經(jīng)元死亡導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病如癲癇、老年癡呆等。
GltPh如右圖所示，由一個(gè)固定在膜上的三聚體結(jié)構(gòu)域（橙色）和一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域（藍(lán)色）組成。在有鈉離子和谷氨酸的環(huán)境下，轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域可移動(dòng)至膜的對(duì)側(cè)來轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸鹽；在無基底的環(huán)境下，轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域也可以跨膜移動(dòng)。
之前，GltPh的直接動(dòng)態(tài)成像很難實(shí)現(xiàn)，RIBM的超高速視頻原子力顯微鏡（HS-AFM）攻克了這一難關(guān)，向我們展示了GltPh的跨膜升降運(yùn)動(dòng)。
實(shí)驗(yàn)開始前，研究人員將GltPh純化后與脂類組成的囊泡整合成跨膜結(jié)構(gòu)，并用HS-AFM觀察。
在無基底的環(huán)境下，GltPh的三聚體結(jié)構(gòu)清晰可見。當(dāng)每個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域暴露在胞外的部分朝向顯微鏡的探針，即處于上升（up）狀態(tài)，突出的部分形成了一個(gè)三角形，中間則形成空洞（t=57s）；每個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域也可朝向胞內(nèi)（t=58s），此時(shí)處于下降（down）狀態(tài)。
環(huán)境中單加入鈉鹽時(shí)，GltPh處于上升狀態(tài)的平均時(shí)間為33s，這意味著GltPh僅結(jié)合Na 離子時(shí)跨膜運(yùn)動(dòng)受到抑制。
加入充足的鈉鹽和谷氨酸，使環(huán)境濃度達(dá)到飽和后，GltPh處于上升狀態(tài)的平均時(shí)間為 11.1 s，開始進(jìn)行活躍的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)。
以上的結(jié)果證實(shí)了，當(dāng)Na 和谷氨酸同時(shí)存在或缺失時(shí)，GltPh的跨膜運(yùn)動(dòng)相對(duì)于僅有Na 時(shí)更加活躍，GltPh是Na 和谷氨酸的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)載體。
HS-AFM在進(jìn)行高速成像的同時(shí)，保持了很高的空間分辨率，可以清晰地分辨三聚體的每一個(gè)結(jié)構(gòu)域，使得我們可以對(duì)不同結(jié)構(gòu)域運(yùn)動(dòng)之間的關(guān)系進(jìn)行研究。
我們針對(duì)一個(gè)GltPh三聚體，通過視頻統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)計(jì)算了其處于不同狀態(tài)（結(jié)構(gòu)域處于上升狀態(tài)的數(shù)量）的概率，結(jié)果與使用自由能公式計(jì)算出來的概率一致。
進(jìn)一步對(duì)結(jié)構(gòu)域運(yùn)動(dòng)的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，可以得出三聚體的結(jié)構(gòu)域之間運(yùn)動(dòng)是相互立的，這也直接驗(yàn)證了之前的研究結(jié)果。
小結(jié)：使用HS-AFM獲得的高空間&時(shí)間分辨率的視頻圖像，可以準(zhǔn)確地反應(yīng)生物大分子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，用于定量研究。
這項(xiàng)工作的完成主要借助了日本RIBM公司研發(fā)的超高速視頻原子力顯微鏡HS-AFM，HS-AFM突破了傳統(tǒng)原子力顯微鏡“掃描成像速慢”的限制，能夠?qū)崿F(xiàn)在液體環(huán)境下超快速動(dòng)態(tài)成像，分辨率為納米水平。待測樣品無需特殊固定，不影響生物分子的活性，尤其適用于生物大分子互作動(dòng)態(tài)觀測。推出至今，全球已有100多位用戶，發(fā)表SCI論文300余篇，其中包括Science, Nature, Cell 等頂級(jí)雜志。
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視頻級(jí)原子力
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