酶標(biāo)儀在蛋白質(zhì)的相互作用驗(yàn)證的應(yīng)用

兩種或多種蛋白質(zhì)之間的相互作⽤促進(jìn)多種生物功能的發(fā)揮，構(gòu)成生理過程的基礎(chǔ)。探究蛋⽩質(zhì)的相互作⽤對于了解健康和疾病的生理過程至關(guān)重要。因此，蛋白質(zhì)科學(xué)和相互作用方法可被視為生物和醫(yī)學(xué)研究中最廣泛的應(yīng)用之一，并構(gòu)成了藥理學(xué)理論的基礎(chǔ)之一。酶標(biāo)儀的運(yùn)用使全面記錄蛋白質(zhì)結(jié)合事件成為可能。

尋找研究蛋白質(zhì)互作的最佳方法

近年來，酶標(biāo)儀的使用徹底改變了蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域，這主要?dú)w功于檢測方法眾多。找到合適方法對于確保高數(shù)據(jù)質(zhì)量和精確結(jié)果至關(guān)重要。雖然在利用酶標(biāo)儀研究蛋白質(zhì)相互作用的應(yīng)用中，一些基于吸光度的方法（如夾心ELISA）仍在使用，但基于熒光或化學(xué)發(fā)光的方法如今更為常見，這是因?yàn)闊晒饣蚧瘜W(xué)發(fā)光法具有靈敏度高、高通量兼容性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。在這方面，通常采用基于福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）的檢測方法。BRET和FRET都是基于兩個信號分子之間的能量轉(zhuǎn)移。通過將兩個信號分子連接到兩個相關(guān)蛋白質(zhì)上，利用這種信號轉(zhuǎn)移來檢測二者之間的相互作用。兩種蛋白質(zhì)之間的結(jié)合使附著的信號分子在空間上相互靠近，從而實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移（圖1）。

圖1：使用CFP和YFP進(jìn)行 FRET檢測的示例。A) CFP 和 YFP 的光譜：CFP（供體）發(fā)射光譜與YFP（受體）激發(fā)光譜發(fā)生重疊（光譜重疊）。B) FRET示意圖：在兩種蛋白質(zhì)沒有相互作用的情況下，CFP被激發(fā)并發(fā)出特定波長的光。C) 當(dāng)兩者發(fā)生相互作用，F(xiàn)RET發(fā)生，YFP發(fā)出另一種波長的光，而CFP的發(fā)光強(qiáng)度會被淬滅。

基于BRET和FRET原理開發(fā)的先進(jìn)應(yīng)用可進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)相互作用測量的靈敏度和讀出質(zhì)量。比如在基于NanoBRET技術(shù)的應(yīng)用中，使用從深海蝦中提取的 NanoLuc® 熒光素酶作為信號分子，與傳統(tǒng)的熒光素酶相比，信號輸出量大大增加。

下面的例子基于NanoBRET方法，能夠檢測蛋白質(zhì)的泛素化過程。泛素標(biāo)記需要被細(xì)胞內(nèi)的酶降解的蛋白質(zhì)，這一過程由蛋白質(zhì)靶向嵌合體（PROTACs）促進(jìn)。PROTACs的這一特性為靶向降解與疾病有關(guān)的蛋白質(zhì)提供了特殊的治療潛力。我們通過動力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究蛋白質(zhì)BRD4的泛素化。為此，利用CRISPR/Cas-9基因組編輯技術(shù)用HiBiT（NanoLuc熒光素酶的一個亞基）標(biāo)記BRD4。并且用NanoBRET受體 HaloTag® 標(biāo)記單個泛素分子。通過PROTAC ARV-771對BRD4進(jìn)行泛素化，使 NanoLuc熒光素酶靠近被標(biāo)記的泛素分子，從而使 BRET 信號以濃度依賴的方式隨著泛素化的進(jìn)行而增加（圖2）。

圖2：監(jiān)測蛋白質(zhì)BRD4泛素化的NanoBRET試驗(yàn)。在泛素化過程中，隨著泛素與BRD4在空間上的接近，與BRD4相耦合的NanoLuc熒光素酶和與泛素分子相耦合的HaloTag之間基于BRET的能量轉(zhuǎn)移增加。

這一應(yīng)用實(shí)例證明，在檢測極低濃度的PROTAC時，基于NanoBRET的方法靈敏度較高。

TR-FRET是將時間分辨測量與FRET原理相結(jié)合，使用的信號分子隨著時間的推移具有很高的信號穩(wěn)定性。這樣就可以利用時間窗口來測量蛋白質(zhì)之間的相互作用，在相互作用信號仍可被檢測到的同時，來自檢測背景的信號已大部分消退，從而大大提高了靈敏度。基于TR-FRET的檢測通常用于研究受體與其配體的相互作用。

酶標(biāo)儀在蛋白質(zhì)互作研究中發(fā)揮的作用

由于上述蛋白質(zhì)相互作用測定通常是在高通量條件下進(jìn)行的，因此將臺式測定轉(zhuǎn)換為自動化高通量篩選（HTS）測定會受到一些特定的限制。其中的重要因素是酶標(biāo)儀的靈敏度和速度，以及自動化兼容性。通過分析相互作用測量的結(jié)合曲線，可以深入了解蛋白質(zhì)互作的結(jié)合動力學(xué)、解離常數(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)。包括所有BMG LABTECH設(shè)備在內(nèi)的先進(jìn)酶標(biāo)儀還可提供動力學(xué)測量，支持結(jié)合曲線的測量。

圖3：BMG LABTECH的PHERAstar® FSX是一款HTS專用多功能酶標(biāo)儀。配備專用功能，是研究蛋白質(zhì)相互作用的利器。

HTS專用多功能酶標(biāo)儀（如BMG LABTECH的PHERAstar® FSX）是解決這些問題的理想檢測平臺。由于可提供所有常用的檢測模式，并能滿足篩選所需的性能，為檢測選擇提供了充分的靈活性。除此之外，PHERAstar® FSX酶標(biāo)儀還可配備專用功能，用于更詳細(xì)、更靈敏地分析蛋白質(zhì)相互作用。板載試劑移液器、同時檢測兩個發(fā)射信號（SDE）和超高速采樣等功能可實(shí)現(xiàn)高通量實(shí)時動力學(xué)相互作用分析。與各種機(jī)械臂平臺和軟件接口的兼容性還可使檢測實(shí)現(xiàn)完全自動化。

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