DAP-seq與RNA-seq聯(lián)合分析助力揭示AvERF73參與調(diào)控獼猴桃的耐澇性

澇害（Waterlogging）是長(zhǎng)期陰雨或暴雨后，由于地表積水，地面徑流不能及時(shí)排除，積水深度過(guò)大，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成作物根部氧氣不足，并產(chǎn)生乙醇等有毒有害物質(zhì)，從而影響作物生長(zhǎng)，甚至造成作物死亡，造成農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的災(zāi)害。
獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）也稱奇異果，原產(chǎn)于中國(guó)。獼猴桃因其獨(dú)特的風(fēng)味，富含維生素C，被譽(yù)為水果之王。目前已經(jīng)躋身于世界主流消費(fèi)水果之列。獼猴桃可以預(yù)防老年骨質(zhì)疏松，抑制膽固醇的沉積，防治動(dòng)脈硬化，改善心肌功能，防治心臟病，也能對(duì)抗癌起作用。
2024年2月2日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所果樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究成果，發(fā)表在Horticultural Plant Journal期刊上（IF=5.7），文章題目為“AvERF73 positively regulates waterlogging tolerance in kiwifruit by participating in hypoxia response and mevalonate pathway” 。該研究使用DNA親和測(cè)序（DAP-seq）技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)揭示了AvERF73通過(guò)參與低氧應(yīng)答和甲羥戊酸途徑，正調(diào)控獼猴桃的耐澇性。

作者在A. valvata KR5中鑒定出一個(gè)受洪澇誘導(dǎo)的ERF-VII基因，命名為AvERF73。隨后，作者檢測(cè)了AvERF73在不同組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在根系中的含量最高。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示，AvERF73與AcERF74的蛋白序列最接近。蛋白序列分析顯示，AvERF73含有一個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域含有Ala14和Asp19保守位點(diǎn)，說(shuō)明AvERF73屬于ERF轉(zhuǎn)錄家族。之后作者將AvERF73與GFP融合表達(dá)，并在細(xì)胞核中檢測(cè)到GFP熒光，證明AvERF73定位于細(xì)胞核中。

為研究AvERF73基因的功能，作者在擬南芥中過(guò)表達(dá)AvERF73基因，進(jìn)行澇脅迫，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)植株比WT植株更耐澇害，證實(shí)了AvERF73的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥的耐澇害能力。

為進(jìn)一步證實(shí)AvERF73在獼猴桃中的作用，作者利用“紅陽(yáng)”獼猴桃葉條外植體轉(zhuǎn)化獲得了兩個(gè)過(guò)表達(dá)的獼猴桃品系OE53和OE65。澇脅迫后， 與過(guò)表達(dá)品系相比，WT植株出現(xiàn)了明顯的葉片枯萎癥狀，葉綠素水平降低，根部H₂O₂和MDA含量升高，而過(guò)表達(dá)品系生長(zhǎng)良好。表明AvERF73在應(yīng)對(duì)澇脅迫方面發(fā)揮著有益的作用。

為了更好地探究AvERF73在澇脅迫下的分子機(jī)制，作者對(duì)OE53和WT植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）。qRT-PCR檢測(cè)和相關(guān)性分析均表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在澇脅迫下，與WT植株相比，OE53植株的上調(diào)基因在“cellular response to hypoxia”途徑顯著富集，這些低氧應(yīng)答基因（HRGs )包含很多轉(zhuǎn)錄因子，例如LOB，WRKY，鋅指蛋白和NAC。，此外，上調(diào)基因在萜類化合物和甾醇生物合成過(guò)程也顯著富集，并且編碼MVA途徑關(guān)鍵酶的基因表達(dá)上調(diào)。由此推測(cè)AvERF73可能調(diào)控HRGs的表達(dá)，同時(shí)激活MVA通路積累萜類化合物和甾醇來(lái)應(yīng)對(duì)澇脅迫。

 

為了鑒定AvERF73調(diào)控的靶基因，作者以O(shè)E53和WT植物的根部為材料進(jìn)行了DAP-seq。兩次重復(fù)共鑒定到3744個(gè)基因，同時(shí)鑒定到AvERF73結(jié)合的GCC-box (‘GCCGCC’) motif。隨后作者將DAP-seq與RNA-seq數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，找到了16個(gè)上調(diào)的AvERF73 可能直接靶向基因（DTGs）并進(jìn)行重點(diǎn)關(guān)注。

為了進(jìn)一步揭示AvERF73的潛在DTG。Venn圖分析發(fā)現(xiàn)，在"cellular response to hypoxia"和MVA途徑中，AcNAC022和AcHMGS1基因?yàn)锳vERF73的潛在DTGs。Dual-Luc實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AcNAC022和AcHMGS1與AvERF73蛋白呈正相關(guān)關(guān)系。據(jù)此推測(cè)，AvERF73調(diào)控了AcNAC022和AcHMGS1的表達(dá)。

結(jié)果表明，AvERF73是獼猴桃耐澇性的重要調(diào)節(jié)因子。一方面，過(guò)表達(dá)AvERF73可以激活AcNAC022的表達(dá)，以應(yīng)對(duì)澇脅迫引起的缺氧。另一方面，過(guò)表達(dá)AvERF73可能通過(guò)直接激活AcHMGS1表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)合成萜類化合物和甾醇的MVA途徑。然而，AvERF73與AcNAC022和AcHMGS1的相互作用調(diào)控獼猴桃耐澇能力的機(jī)制有待進(jìn)一步探索。本研究結(jié)果為研究獼猴桃耐澇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了候選基因和新思路。