利用小型有機(jī)染料納米團(tuán)簇提升 NIR-II 成像引導(dǎo)的手術(shù)效果

本文要點(diǎn)：通過熒光引導(dǎo)手術(shù)（FGS），可以大大提高實(shí)體瘤患者的手術(shù)準(zhǔn)確性。然而，現(xiàn)有的FGS技術(shù)由于其低穿透深度和靈敏度/選擇性而存在局限性，這在相對(duì)較短的成像窗口（<900 nm）中尤為普遍。使用近紅外二區(qū)（NIR-II）FGS，通過在長成像窗口（>900 nm）下的低自發(fā)熒光和散射，可以有效解決這些問題。然而，有機(jī)染料固有的自組裝性導(dǎo)致材料在主要器官大量積累，導(dǎo)致明顯的背景信號(hào)和潛在的長期毒性。

本文基于供體-受體-供體的染料的供體結(jié)構(gòu)，以控制自組裝過程。最終控制形成超小染料納米團(tuán)簇，從而促進(jìn)腎臟排泄并最大限度地減少背景信號(hào)。該染料納米團(tuán)簇不僅可以顯示清晰的血管成像、腫瘤和腫瘤前哨淋巴結(jié)的定位，還可以實(shí)現(xiàn)腫瘤陽性前哨淋巴結(jié)的高性能NIR-II成像引導(dǎo)手術(shù)。通過這項(xiàng)研究表明，基于染料納米團(tuán)簇的 NIR-II FGS 顯著改善了根治性淋巴結(jié)清掃術(shù)的結(jié)果。

 

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這項(xiàng)研究的目標(biāo)是通過合理地設(shè)計(jì)供體結(jié)構(gòu)，來控制S-D-A-D-S染料的組裝過程。研究結(jié)果表明，將己基叔（乙二醇）鏈連接到呋喃供體會(huì)導(dǎo)致 S-D-A-D-S 染料組裝成小的納米團(tuán)簇。這些染料納米團(tuán)簇可以通過腎臟迅速排泄，并且不會(huì)積聚在肝臟和骨髓等免疫器官中。染料納米團(tuán)簇提供高性能的NIR-II血管造影和淋巴造影。它們還能夠?qū)崿F(xiàn)高性能的 NIR-II 成像引導(dǎo)手術(shù)，使腫瘤相鄰的前哨淋巴結(jié)通過光學(xué)成像進(jìn)行區(qū)分，從而顯著改善小鼠模型中原位乳腺癌腫瘤手術(shù)的結(jié)果（圖 1）。該方法可以克服 FGS 近紅外 II 探針的局限性，并為更有效和準(zhǔn)確的成像引導(dǎo)手術(shù)干預(yù)鋪平道路。

圖1. 具有腎臟排泄特性的NIR-II BFC6TP 納米團(tuán)簇，可實(shí)現(xiàn)高性能NIR-II 成像引導(dǎo)手術(shù)以及淋巴結(jié)（LN）、血管和腫瘤成像。

 

S-D-A-D-S 染料可控地自組裝成納米團(tuán)簇及其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)

該研究合成了兩個(gè)用于 NIR-II 成像的明亮探針，分別命名為 BFC6P 和 BFC6TP，它們與兩條 1.5 kDa 的聚乙二醇 （PEG） 鏈偶聯(lián)（如圖2a，b）。BFC6P和BFC6TP在約730 nm處具有吸收峰，并具有約為1050 nm的NIR-II熒光發(fā)射（圖1）。2c， d）。當(dāng)溶解在水溶液中時(shí)，S-D-A-D-S染料可以自發(fā)組裝成納米顆粒。研究發(fā)現(xiàn)，將屏蔽單元從芴改為苯會(huì)導(dǎo)致自組裝染料納米團(tuán)簇形成的尺寸減小，導(dǎo)致藥代動(dòng)力學(xué)從肝膽向腎臟排泄發(fā)生變化。在這項(xiàng)研究中，將供體單元從己基呋喃（BFC6P）替換為己基叔（乙二醇）呋喃（BFC6TP），這導(dǎo)致染料納米團(tuán)簇的尺寸進(jìn)一步減�。▓D2e-j）。DLS測(cè)得的水合直徑BFC6TP和BFC6P的水合直徑分別為40.1 nm±8.6 nm和84.7 ± 24.2 nm，而100 k超濾后的粒徑分別為2.9 ± 1.4 nm和3.2 ± 0.2 nm。然而，分子的聚集行為受多種因素的影響，如濃度、溶出緩沖液和溫度，但在所有的體外測(cè)量中，BFC6TP納米團(tuán)簇的尺寸始終小于BFC6P納米團(tuán)簇的尺寸。這進(jìn)一步證明了BFC6TP的設(shè)計(jì)有效。

圖2. S-D-A-D-S染料可控地自組裝成染料納米團(tuán)簇，而供體工程提供了一種控制自組裝過程的策略，從而形成超小染料納米團(tuán)簇。

 

體外細(xì)胞毒性和細(xì)胞成像測(cè)試證明，我們的染料具有良好的生物相容性和成像能力。然后，研究了小鼠靜脈注射BFC6TP納米團(tuán)簇后BFC6TP納米團(tuán)簇的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。在前5分鐘內(nèi)，在膀胱中檢測(cè)到強(qiáng)熒光信號(hào)，而在肝臟中觀察到弱熒光信號(hào)（圖2k）。與BFC6P納米團(tuán)簇相比，BFC6TP納米團(tuán)簇表現(xiàn)出更快的腎臟清除率和更低的肝臟蓄積（圖2 l）。在藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)期間，觀察到熒光信號(hào)隨時(shí)間推移而耗盡，在 24 小時(shí)時(shí)間點(diǎn)幾乎消失。此外，從PBS過渡到FBS時(shí)觀察到的兩種染料納米團(tuán)簇的尺寸變化表明，兩種類型的納米團(tuán)簇都表現(xiàn)出分解行為。然而，與BFC6TP相比，BFC6P保持了更大的尺寸，這可歸因于BFC6P內(nèi)供體上的烷基鏈導(dǎo)致疏水性增加。這導(dǎo)致肝臟中的保留更大，因此肝臟和腎臟清除率減慢（圖S8）�？偟膩碚f，BFC6TP納米團(tuán)簇的低器官積累提供了更好的成像對(duì)比度，快速的腎臟排泄有助于整體生物安全性，使其非常適合NIR-II成像和成像引導(dǎo)手術(shù)（圖2m）。

BFC6TP納米團(tuán)簇可實(shí)現(xiàn)高性能的NIR-II血管造影、淋巴造影和腫瘤成像
BFC6TP納米團(tuán)簇在相對(duì)較短的成像窗口內(nèi)提供高性能的NIR-II血管造影。這對(duì)于需要重復(fù)影像學(xué)的生物事件或病變部位極為重要，因?yàn)橄鄬?duì)較短的影像學(xué)窗口具有最小的背景信號(hào)和高影像學(xué)對(duì)比度。在將BFC6TP納米團(tuán)簇靜脈注射到脫毛的Balb / c小鼠中后，后肢血管逐漸變得可見，在NIR-II成像期間，動(dòng)脈和靜脈血管在選定的時(shí)間點(diǎn)均可區(qū)分，顯示出顯著的成像對(duì)比度（圖3a， b）。五個(gè)選定感興趣區(qū)域的血管與肌肉的比率均高于 2（圖 4c）。在較長的亞NIR-II窗口下成像進(jìn)一步增強(qiáng)了成像對(duì)比度，導(dǎo)致大腦和后肢的血管與肌肉比增加（圖3d 和 e）。

圖3 BFC6TP納米團(tuán)簇可實(shí)現(xiàn)高性能的NIR-II血管造影、淋巴造影、成像引導(dǎo)手術(shù)和腫瘤成像。

 

BFC6TP納米團(tuán)簇還支持高性能的NIR-II淋巴造影和成像引導(dǎo)手術(shù)。腳墊注射BFC6TP納米團(tuán)簇后，NIR-II淋巴造影顯示前哨淋巴結(jié)清晰（圖3f）。瘤內(nèi)注射BFC6TP納米團(tuán)簇后，繪制了時(shí)間依賴性LN與肌肉和腫瘤與肌肉的比率（圖3g，h）顯示前哨LN可以清晰地可視化。因此，BFC6TP納米團(tuán)簇有助于通過NIR-II成像引導(dǎo)手術(shù)精確切除腫瘤浸潤性前哨LN。BFC6TP納米團(tuán)簇還提供了位于小鼠乳房的遠(yuǎn)端淋巴結(jié)和遠(yuǎn)端腫瘤的成像。BFC6TP納米團(tuán)簇被發(fā)現(xiàn)沿著淋巴系統(tǒng)遷移到腫瘤，因此對(duì)于癌癥手術(shù)期間的術(shù)中腫瘤可視化至關(guān)重要。在患有乳腺異種移植 4T1 腫瘤的小鼠尾部附近皮內(nèi)注射 BFC6TP 納米團(tuán)簇后，探針照亮了前哨淋巴結(jié) （SLN） 和淋巴管系統(tǒng)，隨著時(shí)間的推移逐漸出現(xiàn)強(qiáng)烈的腫瘤信號(hào)（圖3i）。這表明隨著時(shí)間的推移，探針可以從注射部位遷移到 SLN、更高級(jí)別的淋巴結(jié)和遠(yuǎn)端腫瘤。在尾部堿基注射后24小時(shí)內(nèi)，腫瘤和SLNs保持高度分離，熒光強(qiáng)度相對(duì)較高（圖1）。4J）。此外，將BFC6TP納米簇靜脈注射到4T1荷瘤小鼠中可提高NIR-II腫瘤成像能力，在注射后9小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)腫瘤中的最大信號(hào)積累（圖3k）。循環(huán)24 h后，4T1腫瘤中仍有高信號(hào)（圖3l），表明BFC6TP納米團(tuán)簇在內(nèi)部原發(fā)腫瘤被動(dòng)靶向方面的潛在應(yīng)用。同時(shí)識(shí)別腫瘤和腫瘤引流 SLN 的能力對(duì)各種癌癥（包括乳腺癌和皮膚黑色素瘤）的非侵入性診斷和影像學(xué)引導(dǎo)手術(shù)具有重要意義。

BFC6TP納米團(tuán)簇術(shù)中NIR-II成像引導(dǎo)手術(shù)有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移
為了實(shí)現(xiàn)SLNs的精確圖像引導(dǎo)切除并抑制腫瘤復(fù)發(fā)，在4T1荷瘤小鼠中進(jìn)行~25 μL BFC6TP（350 μM）納米團(tuán)簇的腫瘤內(nèi)注射，以對(duì)SLNs進(jìn)行成像。建立具有原位乳腺癌模型的小鼠，并將其隨機(jī)分為四組：未治療組（第 1 組，對(duì)照組）、SLN 切除組（第 2 組）、腫瘤切除組（第 3 組）和 SLN 和腫瘤均被切除的組（第 4 組）。在高分辨率NIR-II成像下，胸肱淋巴結(jié)的腫瘤鄰近SLN從周圍組織精確可見。NIR-II 成像引導(dǎo)手術(shù)是通過切除 SLN、腫瘤或兩者的組合進(jìn)行的，然后仔細(xì)縫合傷口。在實(shí)驗(yàn)期間每天監(jiān)測(cè)四組小鼠的腫瘤體積和體重。37天后，處死小鼠，并評(píng)估離體腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用（圖4a）。手術(shù)切除原發(fā)腫瘤或SLNs可以通過中斷腫瘤轉(zhuǎn)移途徑顯著延長小鼠的存活時(shí)間�？傮w而言，原發(fā)腫瘤和SLN切除的第4組對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的抑制效果最好。

圖4. 術(shù)中NIR-II成像引導(dǎo)的腫瘤/腫瘤鄰近SLNs切除可有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。a 描述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和工作流程的方案

 

結(jié)論：
綜上所述，熒光引導(dǎo)手術(shù)（FGS）是一種很有前途的提高實(shí)體瘤患者手術(shù)準(zhǔn)確性的技術(shù)。然而，目前FGS技術(shù)的局限性促使研究人員開發(fā)了NIR-II FGS，它受益于低自發(fā)熒光和長成像窗口下的散射。NIR-II FGS 可以在工作燈下進(jìn)行，為此開發(fā)理想的 NIR-II 探針很有希望。屏蔽單元-供體-受體-供體-屏蔽單元（S-D-A-D-S）染料已被開發(fā)為一種高度穩(wěn)定的NIR-II探針，但它們的自組裝導(dǎo)致在主要器官中積累，導(dǎo)致明顯的背景信號(hào)和潛在的長期毒性。本研究?jī)?yōu)化了S-D-A-D-S染料的供體結(jié)構(gòu)，形成超小染料納米團(tuán)簇，促進(jìn)腎臟排泄，最小化背景信號(hào)�；�于S-D-A-D-S染料納米團(tuán)簇的NIR-II FGS，大大實(shí)現(xiàn)了高性能的NIR-II成像引導(dǎo)手術(shù)，并改善了根治性淋巴結(jié)清掃術(shù)的結(jié)果，使腫瘤鄰近的前哨淋巴結(jié)具有光學(xué)可辨別性，從而顯著改善了腫瘤手術(shù)的結(jié)果。我們證明，精確切除原發(fā)腫瘤和腫瘤浸潤性 SLN 對(duì)于預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移是必要的，尤其是對(duì)于深部組織的原發(fā)性癌。切除淋巴系統(tǒng)顯著減少腫瘤轉(zhuǎn)移途徑，從而減少肺部和其他器官的轉(zhuǎn)移性病變。本研究中的方法代表了一種有前途的方法，可以克服 FGS 近紅外 II 探針的局限性。

基于ICG的紅外成像程序在數(shù)十萬患者中廣泛進(jìn)行，利用NIR-II窗口的優(yōu)勢(shì)可以提高其臨床結(jié)果。然而，已知ICG具有高度不穩(wěn)定性。因此，開發(fā)具有超穩(wěn)定成像能力的D-A-D染料將為該領(lǐng)域做出重大貢獻(xiàn)。了解 S-D-A-D-S 染料的固有組裝機(jī)制對(duì)于促進(jìn)其臨床轉(zhuǎn)化至關(guān)重要，因?yàn)槔硐氲奶结槕?yīng)在成像后及時(shí)從體內(nèi)排出。此外，NIR-II/PET 雙模成像探頭的未來發(fā)展將為癌癥患者帶來顯著的益處。這些探頭不僅可以為放射治療提供增強(qiáng)的成像引導(dǎo)，還可以使用手術(shù)機(jī)器人進(jìn)行后續(xù)的成像引導(dǎo)手術(shù)。這種在單個(gè)探針中集成多種功能對(duì)于提高癌癥治療的精確度和有效性具有巨大的前景。

 

參考文獻(xiàn)

Wang, Y., Zhou, D., Ma, H. et al. An ultra-small organic dye nanocluster for enhancing NIR-II imaging-guided surgery outcomes. Eur J Nucl Med Mol Imaging (2024).

 

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