InnoQuant在腫瘤微環(huán)境研究中的應(yīng)用-非小細(xì)胞肺癌

研究非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中癌癥組織中的免疫浸潤

 

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌的85%。目前，使用靶向腫瘤特定分子特征的治療藥物已成為標(biāo)準(zhǔn)方案。因此，研究腫瘤組織樣本，以此來表征免疫細(xì)胞和免疫檢查點(diǎn)有助于個(gè)體化的靶向治療。

 

 

1)PD-L1是一種免疫檢查點(diǎn)標(biāo)志物，在髓系細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，并作為癌癥免疫治療的潛在靶點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)中作為腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物。

2)顆粒酶B (Granzyme B，GrB)是一種絲氨酸蛋白酶顆粒酶，主要存在于自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的顆粒中，本實(shí)驗(yàn)中作為NK細(xì)胞標(biāo)志物。

3)CD8存在于T細(xì)胞中，本實(shí)驗(yàn)中作為細(xì)胞毒性T細(xì)胞標(biāo)志物。

4)使用Cell Signaling 公司mIHC熒光抗體進(jìn)行非小細(xì)胞肺癌樣本染色，具體如下: FITC標(biāo)記PD-L1，AF594標(biāo)記CD8，Cy5標(biāo)記GrB。

 

 

1)利用GrB標(biāo)記物鑒定NK細(xì)胞：采用640 nm激發(fā)波長產(chǎn)生Cy5信號，通過680/42 BP濾波器采集其發(fā)射信號。

2)利用CD8標(biāo)記物鑒定T細(xì)胞：采用561nm激發(fā)波長產(chǎn)生AF594信號，通過593/40 BP濾波器采集其發(fā)射信號。

 

 

利用QuPath的深度學(xué)習(xí)功能，分別識別NK細(xì)胞和CD8+ T細(xì)胞。采用Delauney聚類特征2D法鑒定NK細(xì)胞簇和CD8+ T細(xì)胞簇。分析3個(gè)相鄰NK或CD8+ T細(xì)胞所包圍的三角形面積與 腫瘤區(qū)域邊界到NK或CD8+ T細(xì)胞中心距離之間的關(guān)系。

 

 

冷凍切片厚度:5μm。冷凍切片總面積:97 mm²。4個(gè)熒光通道掃描時(shí)間:10分鐘。ROI面積:2 mm²（圖1）。

圖1:NSCLC組織切片全圖，mIHC染色，InnoQuant掃描，后續(xù)分析ROI用黃色圈出

 

 

圖2中黃色標(biāo)記區(qū)域?yàn)槟[瘤細(xì)胞區(qū)域，藍(lán)色標(biāo)記NK細(xì)胞分布在腫瘤細(xì)胞區(qū)域內(nèi)部和外部。圖中大部分NK細(xì)胞集中在腫瘤細(xì)胞區(qū)域周圍，部分NK細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞區(qū)域內(nèi)。

 

圖2:腫瘤細(xì)胞區(qū)域微環(huán)境中NK細(xì)胞簇的ROI和細(xì)節(jié)（腫瘤細(xì)胞區(qū)域用黃色標(biāo)出，NK細(xì)胞呈藍(lán)色；圖片由InnoQuant獲取，QuPath分析）

 

三個(gè)NK細(xì)胞間面積（μm²）被定義為由三個(gè)相鄰NK細(xì)胞圍成的三角形面積。最近腫瘤區(qū)域邊界距離（μm）表示NK細(xì)胞質(zhì)心到最近腫瘤細(xì)胞區(qū)域邊界的距離。如距離為正，則NK細(xì)胞位于腫瘤細(xì)胞區(qū)域外部，如距離為負(fù)，則NK細(xì)胞位于腫瘤細(xì)胞區(qū)域內(nèi)部。

 

對距腫瘤細(xì)胞區(qū)域不同距離的相鄰三個(gè)NK細(xì)胞間面積的分析表明，絕大部分相鄰NK細(xì)胞形成的三角形面積都在600μm²以下，且與腫瘤細(xì)胞區(qū)域邊界的距離都在±12μm的范圍內(nèi)。面積越小，證明NK細(xì)胞密度越高，而且都集中分布在腫瘤區(qū)域周圍。正如圖2中所看到的，NK細(xì)胞的分布受到腫瘤細(xì)胞區(qū)域的影響，絕大部分NK細(xì)胞都圍繞著腫瘤細(xì)胞區(qū)域（圖3）。

圖3:NK細(xì)胞密度與腫瘤細(xì)胞區(qū)域的關(guān)系。左：細(xì)胞圍成的三角形面積與細(xì)胞和腫瘤邊界之間距離的火山圖�？v軸：3個(gè)相鄰NK細(xì)胞圍城的三角形面積。橫軸：NK細(xì)胞中心與腫瘤邊界的距離。右：分布在腫瘤細(xì)胞區(qū)域附近的NK細(xì)胞數(shù)量，按不同距離進(jìn)行分類

 

圖4中黃色標(biāo)記區(qū)域?yàn)槟[瘤細(xì)胞區(qū)域，品紅色標(biāo)記CD8+ T細(xì)胞分布在腫瘤細(xì)胞區(qū)域內(nèi)部和外部。圖中大部分CD8+ T細(xì)胞集中在腫瘤細(xì)胞區(qū)域周圍，部分CD8+ T細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞區(qū)域內(nèi)。

圖4:腫瘤細(xì)胞區(qū)域微環(huán)境中CD8+ T細(xì)胞簇的ROI和細(xì)節(jié)（腫瘤細(xì)胞區(qū)域用黃色標(biāo)出，CD8+ T細(xì)胞呈品紅色；圖片由InnoQuant獲取，QuPath分析）

 

三個(gè)CD8+ T細(xì)胞間面積（μm²）被定義為由相鄰三個(gè)CD8+ T細(xì)胞圍成的三角形面積。最近腫瘤區(qū)域邊界距離（μm）表示CD8+ T細(xì)胞質(zhì)心到最近腫瘤細(xì)胞區(qū)域邊界的距離。如距離為正，則CD8+ T細(xì)胞位于腫瘤細(xì)胞區(qū)域外部。如距離為負(fù)，則CD8+ T細(xì)胞位于腫瘤細(xì)胞區(qū)域內(nèi)部。

 

對距腫瘤細(xì)胞區(qū)域不同距離的相鄰三個(gè) CD8+ T 細(xì)胞間面積的分析表明，絕大部分相鄰CD8+ T細(xì)胞形成的三角形面積都在600μm²以下，且與腫瘤細(xì)胞區(qū)域邊界的距離都在±12um的范圍內(nèi)。面積越小，證明CD8+ T細(xì)胞密度越高，而且都集中分布在腫瘤區(qū)域周圍。說明正如圖4中所看到的，CD8+ T細(xì)胞的分布受到腫瘤細(xì)胞區(qū)域的影響，絕大部分CD8+ T細(xì)胞都圍繞著腫瘤細(xì)胞區(qū)域（圖5）。

圖5: CD8+ T細(xì)胞密度與腫瘤細(xì)胞區(qū)域的關(guān)系。左：細(xì)胞圍成的三角形面積與細(xì)胞和腫瘤邊界之間距離的火山圖�？v軸：3個(gè)相鄰CD8+ T細(xì)胞圍城的三角形面積。橫軸：CD8+ T細(xì)胞中心與腫瘤邊界的距離。右：分布在腫瘤細(xì)胞區(qū)域附近的CD8+ T細(xì)胞數(shù)量，按不同距離進(jìn)行分類

 

 

無論是NK細(xì)胞還是CD8+ T細(xì)胞，都受到腫瘤區(qū)域的影響，集中分布在腫瘤細(xì)胞區(qū)域內(nèi)外，不斷浸潤腫瘤組織。

 

利用全組織掃描成像并結(jié)合深度學(xué)習(xí)算法，可以識別不同免疫細(xì)胞以及分析其與腫瘤區(qū)域的距離。本案例證明了InnoQuant提供的整張掃描圖像可以在第三方分析軟件中生成相關(guān)數(shù)據(jù)。圖像質(zhì)量高，可以得到如細(xì)胞計(jì)數(shù)和鄰近分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以更好地了解患者的特定病理生理狀況。這些空間和定量的數(shù)據(jù)可用于進(jìn)一步預(yù)測免疫腫瘤領(lǐng)域的治療反應(yīng)。

Innopsys 成立于1999年�？偛课挥诜▏�，一直致力于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相關(guān)儀器和軟件的自主研發(fā)和生產(chǎn)。InnoQuant組織切片/生物芯片掃描儀，采用先進(jìn)的共聚焦PMT檢測器和多激光掃描光路，可以同時(shí)進(jìn)行多通道熒光檢測。不僅掃描結(jié)果清晰，而且無需后續(xù)拼接和陰影校正處理，在組織切片和生物芯片掃描領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。

 

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