MeRIP-seq揭示METTL3介導(dǎo)m6A修飾增加Hspa1a穩(wěn)定性以抑制細(xì)胞衰老
老年骨質(zhì)疏松癥主要由成骨細(xì)胞功能衰減引起，進(jìn)而導(dǎo)致骨量減少和骨重塑過程破壞。目前許多研究表明m6A修飾在骨質(zhì)疏松癥的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，但大多數(shù)研究集中在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化的作用上，而m6A對(duì)成骨細(xì)胞的直接調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科夏亞一教授和耿彬教授合作，在老年骨質(zhì)疏松癥患者中揭示了m6A修飾和甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3）表達(dá)降低。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)表明，METTL3抑制了成骨細(xì)胞衰老，而成骨細(xì)胞功能障礙會(huì)影響骨代謝平衡。隨后MeRIP-seq和mRNA-seq聯(lián)合揭示了METTL3調(diào)控Hspa1a轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性。在METTL3抑制成骨細(xì)胞衰老過程中，YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白2（YTHDF2）延緩了Hspa1a mRNA的衰減。METTL3在小鼠成骨細(xì)胞中特異性過表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)METTL3可以抑制老年骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展。相關(guān)研究成果以“METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging”為題發(fā)表在《cell death discovery》期刊上。
標(biāo)題：METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging（METTL3介導(dǎo)的m6A修飾可增加Hspa1a穩(wěn)定性以抑制成骨細(xì)胞衰老）
時(shí)間：2024.3.27
期刊：cell death discovery
影響因子：IF 7/ 2區(qū)
實(shí)驗(yàn)方法：MeRIP-seq、mRNA-seq、Western blot、qRT-PCR、免疫熒光和組織學(xué)染色等
研究摘要：
本研究揭示了老年骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展與m6A修飾和METTL3下調(diào)密切相關(guān)。METTL3過表達(dá)可以抑制成骨細(xì)胞的衰老。甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）揭示了METTL3通過上調(diào)Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性來抑制成骨細(xì)胞衰老。此外，結(jié)果表明METTL3通過m6A修飾增強(qiáng)Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性來調(diào)控成骨細(xì)胞衰老。YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白2（YTHDF2）參與METTL3介導(dǎo)的m6A修飾過程中Hspa1a mRNA的穩(wěn)定。從機(jī)制上講，METTL3以YTHDF2依賴性方式增加Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性，以抑制成骨細(xì)胞衰老。本研究結(jié)果證實(shí)了METTL3在成骨細(xì)胞衰老中的重要作用，并表明METTL3可能是老年骨質(zhì)疏松癥的潛在治療靶點(diǎn)。
結(jié)果圖形：
（1）老年骨質(zhì)疏松癥中m6A修飾減少
為了研究與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失與 m6A 修飾之間的關(guān)系，進(jìn)行比色法檢測(cè)骨組織中的m6A水平。檢測(cè)結(jié)果在老年骨質(zhì)疏松癥患者的骨組織中觀察到m6A修飾水平顯著降低（圖1）。由于m6A修飾主要受甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶調(diào)控，因此在骨組織中檢測(cè)METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1的mRNA水平。
圖1：老年骨質(zhì)疏松癥患者樣本中m6A水平變化以及METTL3等基因和蛋白表達(dá)情況。
a. 老年骨質(zhì)疏松癥患者的骨樣本進(jìn)行了m6A水平的比色評(píng)估。（n=10）
b. 老年骨質(zhì)疏松癥患者樣本進(jìn)行METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1表達(dá)的qRT-PCR分析。（n=10）
c. 小鼠骨質(zhì)疏松癥骨組織進(jìn)行m6A水平的比色評(píng)估。（n=6）
d. western blot分析樣本中的METTL3蛋白水平。（n=6）
e. H2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞衰老過程中m6A水平的比色分析（n=3）。
f. 通過β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞（n=3）。
g. 透射電子顯微鏡分析線粒體形態(tài)（n=3）。
h. western blot分析樣本中METTL3蛋白水平（n=3）。
（2）METTL3 抑制體外成骨細(xì)胞衰老
在衰老過程中，骨微環(huán)境中的各種細(xì)胞類型都會(huì)經(jīng)歷衰老，導(dǎo)致骨形成減少和骨的負(fù)平衡。為了研究成骨細(xì)胞衰老是否歸因于m6A修飾減少和METTL3表達(dá)降低，建立了MC3T3-E1-shMETTL3，并從C57/BL6小鼠的原代成骨細(xì)胞中敲低了METTL3。
圖2：成骨細(xì)胞衰老與METTL3促進(jìn)的m6A變化密切相關(guān)。
a. 對(duì)METTL3基因敲除后的MC3T3-E1細(xì)胞和原代成骨細(xì)胞進(jìn)行m6A水平的比色評(píng)估（n=3）。
b. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞（n=3）。
c. 使用免疫熒光鑒定METTL3和p21的定位和表達(dá)，bar = 20 μm（n = 3）。
d. JC-1染色分析線粒體膜電位，bar =10μm（n = 3）。
e. Western Blot檢測(cè)METTL3、p53、CDK4和p21蛋白水平（n = 3）。
（3）成骨細(xì)胞功能對(duì)體外骨微環(huán)境代謝的影響
圖3：成骨細(xì)胞功能影響骨微環(huán)境。
a. 免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析METTL3和p21的表達(dá)，bar = 20 μm（n = 3）。
b. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞（n=3）。
c. 使用JC-1染色來評(píng)估線粒體膜電位，bar =10μm（n = 3）。
d. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞（n = 3）。
e. EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞增殖，bar =50μm（n = 3）。
（4）MeRIP-seq揭示METTL3調(diào)控Hspa1a穩(wěn)定性
為研究METTL3在調(diào)控成骨細(xì)胞衰老中的潛在分子機(jī)制，研究人員在MC3T3-E1細(xì)胞中激活METTL3后，進(jìn)行了MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序）和mRNA-seq（mRNA測(cè)序）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在MC3T3-E1細(xì)胞中鑒定的m6A位點(diǎn)在 “GGAC”序列中富集（圖4a），大部分m6A位點(diǎn)位于編碼序列（CDS）和3'非翻譯區(qū)（3'UTR）。Metagene分析顯示m6A位點(diǎn)主要位于終止密碼子附近。MeRIP-seq和mRNA-seq分析鑒定出13個(gè)共有顯著基因。驗(yàn)證了7個(gè)顯著上調(diào)的潛在靶標(biāo)，qRT-PCR結(jié)果顯示Nr4a3和Hspa1a上調(diào)更為顯著（圖4b）。在Hspa1a終止密碼子附近發(fā)現(xiàn)m6A峰的高豐度和特異性，表明Hspa1a可能是成骨細(xì)胞衰老的關(guān)鍵調(diào)控因子（圖4c）。通過SRAMP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)揭示Hspa1a mRNA中的多個(gè)高度可靠的m6A修飾位點(diǎn)。在METTL3沉默的MC3T3-E1細(xì)胞系和原代成骨細(xì)胞中，Hspa1a蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（圖4d）。免疫熒光結(jié)果也表明在METTL3沉默后Hspa1a表達(dá)下調(diào)（圖4e）。RIP-qPCR結(jié)果證實(shí)Hspa1a mRNA能直接與METTL3蛋白結(jié)合（圖4f）。MeRIP-qPCR驗(yàn)證了在METTL3沉默的細(xì)胞系中Hspa1a mRNA的m6A修飾水平顯著降低（圖4g）。隨后進(jìn)行RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以分析METTL3介導(dǎo)的m6A修飾對(duì)Hspa1a表達(dá)調(diào)控作用機(jī)制。METTL3沉默后，Hspa1a mRNA的衰減速度顯著快于對(duì)照組（圖4h）。這些結(jié)果表明METTL3增加了Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性并減少了其衰減。通過以上實(shí)驗(yàn)，研究人員揭示了METTL3通過m6A修飾正向調(diào)控Hspa1a mRNA穩(wěn)定性的機(jī)制，并揭示METTL3可能通過這一機(jī)制抑制成骨細(xì)胞衰老。
圖4： MeRIP-seq揭示METTL3調(diào)控Hspa1a穩(wěn)定性。
a. MeRIP-Seq分析顯示，成骨細(xì)胞“GGAC”motif在m6A位點(diǎn)富集。
b. 對(duì)7個(gè)顯著上調(diào)的潛在靶標(biāo)進(jìn)行qRT-PCR分析（n=3）。
c. Hspa1a終止密碼子附近的m6A峰具有高豐度和特異性。
d. Western Blot分析METTL3沉默后Hspa1a蛋白水平（n=3）。
e. 免疫熒光檢測(cè)Hspa1a表達(dá)，bar=20μm（n=3）。
f. RIP-qPCR研究Hspa1a mRNA-METTL3蛋白的直接互作（n=3）。
g. MeRIP-qPCR分析Hspa1a m6A修飾（n=3）
h. qRT-PCR檢測(cè)放線菌素D誘導(dǎo)后的mRNA水平以分析降解情況（n=3）。
（5）METTL3介導(dǎo)的m6A修飾以YTHDF2依賴性方式調(diào)控Hspa1a mRNA衰變
圖5：METTL3介導(dǎo)的m6A修飾以YTHDF2依賴性方式調(diào)控Hspa1a mRNA衰變。
a. JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位，bar=10μm（n=3）。
b. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞（n=3）。
c. 免疫熒光檢測(cè)Hspa1a和p21表達(dá)，bar=20μm（n=3）。
d. Western Blot檢測(cè)METTL3、Hspa1a、YTHDF2和IGF2BP1蛋白水平（n=3）。
e. RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)鑒定與Hspa1a mRNA互作的m6A依賴性蛋白（n=3）。
（6）靶向成骨細(xì)胞中的METTL3可抑制老年性骨質(zhì)疏松癥進(jìn)展
圖6：靶向成骨細(xì)胞中的METTL3可抑制老年小鼠骨質(zhì)疏松癥。
a. 小鼠分組和干預(yù)措施示意圖（n=6）。
b. c. f. 通過組織學(xué)實(shí)驗(yàn)（HE染色、Von Kossa染色和calcein染色，bar=200 μm）來分析小鼠股骨遠(yuǎn)端情況（每組n=3）。
d. 對(duì)小鼠股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行定量micro-CT分析（每組n=3），以評(píng)估骨密度和骨微結(jié)構(gòu)的變化。
e. 通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清中骨代謝標(biāo)志物水平（每組n=3）。
g.利用免疫組化分析骨組織中METTL3、Hspa1a、p53和p21水平（每組n=3），以評(píng)估在骨質(zhì)疏松癥發(fā)展中的作用。
h. METTL3介導(dǎo)的m6A修飾以YTHDF2依賴性方式調(diào)控Hspa1a mRNA衰減，且METTL3通過抑制成骨細(xì)胞衰老來調(diào)控老年骨質(zhì)疏松癥進(jìn)展的示意圖，bar=50 μm。
參考文獻(xiàn)：
Wang Y, Chen Y, Xiao H, Liu Z, Liu X, Feng Z, Sheng X, Peng B, Ren X, Xu L, Teng F, Yi Z, Niu Y, Xiang D, Xia Y, Geng B. METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging. Cell Death Discov. 2024 Mar 27;10(1):155. pii: 10.1038/s41420-024-01925-4. doi: 10.1038/s41420-024-01925-4. PubMed PMID: 38538596.
蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科夏亞一教授和耿彬教授合作，在老年骨質(zhì)疏松癥患者中揭示了m6A修飾和甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3）表達(dá)降低。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)表明，METTL3抑制了成骨細(xì)胞衰老，而成骨細(xì)胞功能障礙會(huì)影響骨代謝平衡。隨后MeRIP-seq和mRNA-seq聯(lián)合揭示了METTL3調(diào)控Hspa1a轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性。在METTL3抑制成骨細(xì)胞衰老過程中，YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白2（YTHDF2）延緩了Hspa1a mRNA的衰減。METTL3在小鼠成骨細(xì)胞中特異性過表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)METTL3可以抑制老年骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展。相關(guān)研究成果以“METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging”為題發(fā)表在《cell death discovery》期刊上。
標(biāo)題：METTL3-mediated m6A modification increases Hspa1a stability to inhibit osteoblast aging（METTL3介導(dǎo)的m6A修飾可增加Hspa1a穩(wěn)定性以抑制成骨細(xì)胞衰老）
時(shí)間：2024.3.27
期刊：cell death discovery
影響因子：IF 7/ 2區(qū)
實(shí)驗(yàn)方法：MeRIP-seq、mRNA-seq、Western blot、qRT-PCR、免疫熒光和組織學(xué)染色等
研究摘要：
本研究揭示了老年骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展與m6A修飾和METTL3下調(diào)密切相關(guān)。METTL3過表達(dá)可以抑制成骨細(xì)胞的衰老。甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）揭示了METTL3通過上調(diào)Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性來抑制成骨細(xì)胞衰老。此外，結(jié)果表明METTL3通過m6A修飾增強(qiáng)Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性來調(diào)控成骨細(xì)胞衰老。YTH N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白2（YTHDF2）參與METTL3介導(dǎo)的m6A修飾過程中Hspa1a mRNA的穩(wěn)定。從機(jī)制上講，METTL3以YTHDF2依賴性方式增加Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性，以抑制成骨細(xì)胞衰老。本研究結(jié)果證實(shí)了METTL3在成骨細(xì)胞衰老中的重要作用，并表明METTL3可能是老年骨質(zhì)疏松癥的潛在治療靶點(diǎn)。
結(jié)果圖形：
（1）老年骨質(zhì)疏松癥中m6A修飾減少
為了研究與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失與 m6A 修飾之間的關(guān)系，進(jìn)行比色法檢測(cè)骨組織中的m6A水平。檢測(cè)結(jié)果在老年骨質(zhì)疏松癥患者的骨組織中觀察到m6A修飾水平顯著降低（圖1）。由于m6A修飾主要受甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶調(diào)控，因此在骨組織中檢測(cè)METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1的mRNA水平。
圖1：老年骨質(zhì)疏松癥患者樣本中m6A水平變化以及METTL3等基因和蛋白表達(dá)情況。
a. 老年骨質(zhì)疏松癥患者的骨樣本進(jìn)行了m6A水平的比色評(píng)估。（n=10）
b. 老年骨質(zhì)疏松癥患者樣本進(jìn)行METTL3、METTL14、FTO和YTHDC1表達(dá)的qRT-PCR分析。（n=10）
c. 小鼠骨質(zhì)疏松癥骨組織進(jìn)行m6A水平的比色評(píng)估。（n=6）
d. western blot分析樣本中的METTL3蛋白水平。（n=6）
e. H2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞衰老過程中m6A水平的比色分析（n=3）。
f. 通過β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞（n=3）。
g. 透射電子顯微鏡分析線粒體形態(tài)（n=3）。
h. western blot分析樣本中METTL3蛋白水平（n=3）。
（2）METTL3 抑制體外成骨細(xì)胞衰老
在衰老過程中，骨微環(huán)境中的各種細(xì)胞類型都會(huì)經(jīng)歷衰老，導(dǎo)致骨形成減少和骨的負(fù)平衡。為了研究成骨細(xì)胞衰老是否歸因于m6A修飾減少和METTL3表達(dá)降低，建立了MC3T3-E1-shMETTL3，并從C57/BL6小鼠的原代成骨細(xì)胞中敲低了METTL3。
圖2：成骨細(xì)胞衰老與METTL3促進(jìn)的m6A變化密切相關(guān)。
a. 對(duì)METTL3基因敲除后的MC3T3-E1細(xì)胞和原代成骨細(xì)胞進(jìn)行m6A水平的比色評(píng)估（n=3）。
b. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞（n=3）。
c. 使用免疫熒光鑒定METTL3和p21的定位和表達(dá)，bar = 20 μm（n = 3）。
d. JC-1染色分析線粒體膜電位，bar =10μm（n = 3）。
e. Western Blot檢測(cè)METTL3、p53、CDK4和p21蛋白水平（n = 3）。
（3）成骨細(xì)胞功能對(duì)體外骨微環(huán)境代謝的影響
圖3：成骨細(xì)胞功能影響骨微環(huán)境。
a. 免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析METTL3和p21的表達(dá)，bar = 20 μm（n = 3）。
b. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞（n=3）。
c. 使用JC-1染色來評(píng)估線粒體膜電位，bar =10μm（n = 3）。
d. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞（n = 3）。
e. EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞增殖，bar =50μm（n = 3）。
（4）MeRIP-seq揭示METTL3調(diào)控Hspa1a穩(wěn)定性
為研究METTL3在調(diào)控成骨細(xì)胞衰老中的潛在分子機(jī)制，研究人員在MC3T3-E1細(xì)胞中激活METTL3后，進(jìn)行了MeRIP-seq（甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序）和mRNA-seq（mRNA測(cè)序）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在MC3T3-E1細(xì)胞中鑒定的m6A位點(diǎn)在 “GGAC”序列中富集（圖4a），大部分m6A位點(diǎn)位于編碼序列（CDS）和3'非翻譯區(qū)（3'UTR）。Metagene分析顯示m6A位點(diǎn)主要位于終止密碼子附近。MeRIP-seq和mRNA-seq分析鑒定出13個(gè)共有顯著基因。驗(yàn)證了7個(gè)顯著上調(diào)的潛在靶標(biāo)，qRT-PCR結(jié)果顯示Nr4a3和Hspa1a上調(diào)更為顯著（圖4b）。在Hspa1a終止密碼子附近發(fā)現(xiàn)m6A峰的高豐度和特異性，表明Hspa1a可能是成骨細(xì)胞衰老的關(guān)鍵調(diào)控因子（圖4c）。通過SRAMP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)揭示Hspa1a mRNA中的多個(gè)高度可靠的m6A修飾位點(diǎn)。在METTL3沉默的MC3T3-E1細(xì)胞系和原代成骨細(xì)胞中，Hspa1a蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（圖4d）。免疫熒光結(jié)果也表明在METTL3沉默后Hspa1a表達(dá)下調(diào)（圖4e）。RIP-qPCR結(jié)果證實(shí)Hspa1a mRNA能直接與METTL3蛋白結(jié)合（圖4f）。MeRIP-qPCR驗(yàn)證了在METTL3沉默的細(xì)胞系中Hspa1a mRNA的m6A修飾水平顯著降低（圖4g）。隨后進(jìn)行RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以分析METTL3介導(dǎo)的m6A修飾對(duì)Hspa1a表達(dá)調(diào)控作用機(jī)制。METTL3沉默后，Hspa1a mRNA的衰減速度顯著快于對(duì)照組（圖4h）。這些結(jié)果表明METTL3增加了Hspa1a mRNA的穩(wěn)定性并減少了其衰減。通過以上實(shí)驗(yàn)，研究人員揭示了METTL3通過m6A修飾正向調(diào)控Hspa1a mRNA穩(wěn)定性的機(jī)制，并揭示METTL3可能通過這一機(jī)制抑制成骨細(xì)胞衰老。
圖4： MeRIP-seq揭示METTL3調(diào)控Hspa1a穩(wěn)定性。
a. MeRIP-Seq分析顯示，成骨細(xì)胞“GGAC”motif在m6A位點(diǎn)富集。
b. 對(duì)7個(gè)顯著上調(diào)的潛在靶標(biāo)進(jìn)行qRT-PCR分析（n=3）。
c. Hspa1a終止密碼子附近的m6A峰具有高豐度和特異性。
d. Western Blot分析METTL3沉默后Hspa1a蛋白水平（n=3）。
e. 免疫熒光檢測(cè)Hspa1a表達(dá)，bar=20μm（n=3）。
f. RIP-qPCR研究Hspa1a mRNA-METTL3蛋白的直接互作（n=3）。
g. MeRIP-qPCR分析Hspa1a m6A修飾（n=3）
h. qRT-PCR檢測(cè)放線菌素D誘導(dǎo)后的mRNA水平以分析降解情況（n=3）。
（5）METTL3介導(dǎo)的m6A修飾以YTHDF2依賴性方式調(diào)控Hspa1a mRNA衰變
圖5：METTL3介導(dǎo)的m6A修飾以YTHDF2依賴性方式調(diào)控Hspa1a mRNA衰變。
a. JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位，bar=10μm（n=3）。
b. β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞（n=3）。
c. 免疫熒光檢測(cè)Hspa1a和p21表達(dá)，bar=20μm（n=3）。
d. Western Blot檢測(cè)METTL3、Hspa1a、YTHDF2和IGF2BP1蛋白水平（n=3）。
e. RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)鑒定與Hspa1a mRNA互作的m6A依賴性蛋白（n=3）。
（6）靶向成骨細(xì)胞中的METTL3可抑制老年性骨質(zhì)疏松癥進(jìn)展
圖6：靶向成骨細(xì)胞中的METTL3可抑制老年小鼠骨質(zhì)疏松癥。
a. 小鼠分組和干預(yù)措施示意圖（n=6）。
b. c. f. 通過組織學(xué)實(shí)驗(yàn)（HE染色、Von Kossa染色和calcein染色，bar=200 μm）來分析小鼠股骨遠(yuǎn)端情況（每組n=3）。
d. 對(duì)小鼠股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行定量micro-CT分析（每組n=3），以評(píng)估骨密度和骨微結(jié)構(gòu)的變化。
e. 通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清中骨代謝標(biāo)志物水平（每組n=3）。
g.利用免疫組化分析骨組織中METTL3、Hspa1a、p53和p21水平（每組n=3），以評(píng)估在骨質(zhì)疏松癥發(fā)展中的作用。
h. METTL3介導(dǎo)的m6A修飾以YTHDF2依賴性方式調(diào)控Hspa1a mRNA衰減，且METTL3通過抑制成骨細(xì)胞衰老來調(diào)控老年骨質(zhì)疏松癥進(jìn)展的示意圖，bar=50 μm。
參考文獻(xiàn)：
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DNA甲基化
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