疫苗生產(chǎn)中抗生素殘留的免疫學(xué)方法

一、疫苗的規(guī)定分類
      疫苗是以病原微生物或其組成成分、代謝產(chǎn)物為起始材料，采用生物技術(shù)制備而成，用于預(yù)防、治療人類相應(yīng)疾病的生物制品。疫苗接種人體后可刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性體液免疫和（或）細胞免疫應(yīng)答，使人體獲得對相應(yīng)病原微生物的免疫力。用于傳染病預(yù)防的人用疫苗，按其組成成分和生產(chǎn)工藝可分為以下類型。
1. 滅活疫苗：病原微生物經(jīng)培養(yǎng)、增殖，用物理化學(xué)方法滅活以去除其增殖能力后制成的疫苗。例如鉤端螺旋體疫苗、甲型肝炎滅活疫苗等。
2. 減毒活疫苗：采用病原微生物的自然弱毒株或經(jīng)培養(yǎng)傳代等方法減毒處理后獲得致病力減弱、免疫原性良好的病原微生物減毒株制成的疫苗。例如鉤端螺旋體疫苗、甲型肝炎滅活疫苗等。
3. 亞單位疫苗：病原微生物經(jīng)培養(yǎng)后，提取、純化其主要保護性抗原成分制成的疫苗。例如A群腦膜炎球菌多糖疫苗、流感亞單位疫苗等。
4. 基因工程重組蛋白疫苗：采用基因重組技術(shù)將編碼病原微生物保護性抗原的基因重組到細菌（如大腸埃希菌）、酵母或細胞，經(jīng)培養(yǎng)、增殖后，提取、純化所表達的保護性抗原制成的疫苗。例如重組乙型肝炎疫苗等。
5. 結(jié)合疫苗：由病原微生物的保護性抗原成分與蛋白質(zhì)載體結(jié)合制成的疫苗。例如重組乙型肝炎疫苗等。
6. 聯(lián)合疫苗：由兩個或以上活的、滅活的病原微生物或抗原成分聯(lián)合配制而成的疫苗，用于預(yù)防不同病原微生物或同一種病原微生物的不同血清型/株引起的疾病。聯(lián)合疫苗包括多聯(lián)疫苗和多價疫苗。例如吸附百白破聯(lián)合疫苗、麻腮風(fēng)聯(lián)合減毒活疫苗，23價肺炎球菌多糖疫苗、流感病毒裂解疫苗。
二、疫苗成品的檢測項目
      疫苗成品檢測項目一般包括鑒別試驗、理化測定、純度、效力測定、異常毒性檢查、無菌檢查、細菌內(nèi)毒素檢查、佐劑、抑菌劑及工藝雜質(zhì)殘留量檢測等。疫苗的工藝雜質(zhì)主要包括以傳代細胞生產(chǎn)的病毒性疫苗中宿主細胞蛋白質(zhì)和DNA殘留，以及生產(chǎn)過程中用于培養(yǎng)、滅活、提取和純化等工藝過程的化學(xué)、生物原材料殘留物，如牛血清、甲醛和β-丙內(nèi)酯等滅活劑、抗生素殘留等。對于與疫苗關(guān)鍵質(zhì)量屬性相關(guān)的工藝雜質(zhì)（如細胞基質(zhì)殘留蛋白質(zhì)和細胞基質(zhì)殘留DNA，抗生素、核酸酶、殘余牛血清等），如因產(chǎn)品特性無法在成品中檢測時，應(yīng)在適當?shù)闹虚g產(chǎn)物（如原液或半成品）取樣檢測，其檢測結(jié)果應(yīng)能準確反映每一成品劑量中的殘留水平。對于一般工藝雜質(zhì)，如經(jīng)充分驗證證明生產(chǎn)工藝可對其有效、穩(wěn)定地去除或控制，并持續(xù)達到可接受的水平或殘留水平處于分析方法的檢測限以下，相關(guān)殘留物檢測可不列入產(chǎn)品的檢定項目中。
三、生物制品中常用的抗生素
      生物制品在菌株構(gòu)建藥物篩選及生產(chǎn)過程中，為了防止細菌污染等原因，會添加某些種類的抗生素。在預(yù)防類生物制品（疫苗）中常添加新霉素、紅霉素、慶大霉素，其中紅霉素可引起耳聾和周圍神經(jīng)炎，慶大霉素除了引起過敏之外，在臨床上如果用于嬰幼兒，可以造成永久性的神經(jīng)性耳聾。在治療類生物制品（如重組蛋白、單克隆抗體等）中常添加的氨芐西林、四環(huán)素、卡那霉素等，其中氨芐西林易引發(fā)過敏反應(yīng)，卡那霉素影響耳蝸神經(jīng)并具有腎毒性。
       國家食品藥品監(jiān)督管理局要求在生物制品生產(chǎn)過程中應(yīng)盡可能避免使用抗生素，必須使用時，應(yīng)選擇安全性風(fēng)險相對較低的抗生素品種，且產(chǎn)品的后續(xù)純化工藝應(yīng)保證可有效去除制品中的抗生素；如后續(xù)工藝不能有效去除，則不得添加。病毒性疫苗生產(chǎn)中僅允許在細胞制備、細胞增殖過程中使用抗生素。使用抗生素時，成品檢定中應(yīng)檢測抗生素殘留量，并規(guī)定殘留量限值。嚴禁使用青霉素或其他β-內(nèi)酰胺類抗生素。目前2020版《中國藥典》收錄了微生物培養(yǎng)法和酶聯(lián)免疫法兩種。2020版《中國藥典》規(guī)定，生產(chǎn)過程中加入抗生素的應(yīng)進行抗生素殘留量檢測，采用酶聯(lián)免疫吸附法（通則3429），應(yīng)不高于50ng/劑。
四、抗生素免疫學(xué)檢測方法
      免疫學(xué)具有高通量、操作簡單、檢測時間短等優(yōu)勢，成為疫苗生產(chǎn)中檢測抗生素殘留的常用手段。檢測方法常用的包括酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析法。
1. 酶聯(lián)免疫吸附法
檢測原理：通�；�于競爭性免疫檢測原理，以卡那霉素為例�？�那霉素與預(yù)包被在板上的卡那霉素蛋白偶聯(lián)物競爭結(jié)合有限的抗卡那霉素的抗體，然后加入酶結(jié)合物反應(yīng)，形成酶結(jié)合物—抗卡那霉素抗體—卡那霉素蛋白偶聯(lián)物復(fù)合物，洗滌除去未結(jié)合的反應(yīng)物，經(jīng)TMB底物顯色產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，加終止液后，產(chǎn)物由藍色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，其在450nm下有最大吸收峰。樣本中卡那霉素含量與樣本的吸光度呈負相關(guān)。
2. 免疫層析法
檢測原理：以四環(huán)素為例。四環(huán)素快速檢測試紙條應(yīng)用了競爭抑制免疫層析的原理，樣品中的四環(huán)素在流動的過程中與膠體金標記的特異性四環(huán)素單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體和NC膜檢測線上的四環(huán)素-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色的深淺變化。當樣品中不含有四環(huán)素或濃度低于檢測限時，T線顯色強于C線顯色或與C線顯色一致。當樣品中的四環(huán)素濃度等于或高于檢測限時，T線顯色明顯弱于C線顯色或T線不顯色。而無論樣品中是否含有四環(huán)素質(zhì)控線C線都會顯色，以示檢測有效。