細胞與基因治療：如何保證細胞計數(shù)準確高效？

你是否在為計數(shù)尺寸較小的PBMC、T細胞等而發(fā)愁？
在篩選用于輸血的紅細胞時，為避免免疫反應(yīng)，對不同細胞類型進行區(qū)分尤為重要，而臺盼藍無法區(qū)分，這一問題該如何解決？
本文提供了使用熒光染料、借助高通量熒光細胞計數(shù)儀快速準確對細胞計數(shù)、鑒別的方式。

吖啶橙（AO）等熒光染料可以更準確地計數(shù)血液樣本中的白細胞，這是一項有助于對抗血癌的創(chuàng)新方法。
血癌——包括淋巴瘤、白血病和骨髓瘤，通常難以治療。傳統(tǒng)的化療和放療療效有限，特別是在復(fù)發(fā)或?qū)χ委熡械挚沟那闆r下容易引起嚴重的副作用。
最近出現(xiàn)的新療法，特別是嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法，有希望解決這些復(fù)雜的疾病。CAR-T細胞療法包括提取患者自身的免疫T細胞，對它們進行基因工程改造靶向癌細胞，然后將它們重新引入患者體內(nèi)。
這種方法在治療血癌方面取得了顯著的成功。然而，要使CAR-T細胞療法充分發(fā)揮其潛力，臨床醫(yī)生需要了解每個樣品中免疫細胞的準確數(shù)量和質(zhì)量。
 
自動計數(shù)
位于韓國首爾的一家名為NanoEntek的公司于2000年代初期開始研究可行的解決方案。該公司的研究人員探索了微流控技術(shù)對改善血液樣本細胞計數(shù)的潛力。
傳統(tǒng)方法使用臺盼藍染料，該染料僅染色死細胞。病理學(xué)家通過手動計算細胞總數(shù)，然后減去染色死細胞的數(shù)量來確定細胞活力。
然而，這種方法是費時費力的。NanoEnTek意識到需要更好的解決方案，于是開發(fā)了使用自動化細胞計數(shù)的方法。通過引入自動細胞計數(shù)儀，該公司使該過程更加一致、準確，并操作簡便。此外，通過使用自動化高通量細胞計數(shù)儀，顯著提高了細胞計數(shù)的效率。
 

細胞鑒別
隨著技術(shù)的進步，傳統(tǒng)方法的可靠性越來越低。這體現(xiàn)在進行細胞治療研究時，原代細胞、外周血單核細胞 （PBMC） 和干細胞等多種細胞類型的計數(shù)不準確。
例如，臺盼藍的顯著局限性是它無法區(qū)分紅細胞和PBMC。在篩選用于輸血的紅細胞時，對不同細胞類型進行區(qū)分尤為重要，因為白細胞的存在可能會引起受者的免疫反應(yīng)。
熒光染料如AO和DAPI通過選擇性染色細胞核來克服這一限制。因此，這可以幫助研究人員和臨床醫(yī)生輕松區(qū)分具有細胞核的白細胞和缺乏細胞核的紅細胞。
此外，手動計數(shù)難以對體積小的血細胞進行準確計數(shù)。熒光染料可以克服這個問題，因為它們選擇性地對細胞核進行染色，并在顯微鏡下觀察時發(fā)出強烈的熒光。因此，它們甚至可以更精準地測量最小的細胞，如PBMC、T細胞和自然殺傷細胞，這些細胞對細胞治療至關(guān)重要。
此外，NanoEnTek的多幀成像技術(shù)可以進一步提高測量精度。“自動成像系統(tǒng)可以對每個樣本都采集到多張圖像，”NanoEnTek的Chan Park解釋道，“由于所有測量值都是平均的，因此精度得到了顯著提高。”
 
解決復(fù)雜問題
在處理含有污染物的樣品或可能患有污染物的患者的樣品時，基于熒光的方法非常有效。
準確的細胞計數(shù)對細胞和基因治療至關(guān)重要，正在使用NanoEnTek的熒光細胞計數(shù)儀的公司InnoBation Bio的 Beom Choi 說：“準確的活淋巴細胞數(shù)量是材料質(zhì)控的一個簡單而重要的標準，”他解釋道，“如果初始密度測量不正確，一切都會分崩離析。”
免疫系統(tǒng)被激活而導(dǎo)致炎癥是傳統(tǒng)方法的挑戰(zhàn)。這可能導(dǎo)致淋巴細胞樣本被大量紅細胞污染，傳統(tǒng)方法可能會錯誤地將其計為淋巴細胞。“然而，由于紅細胞缺乏細胞核，它們不會吸收熒光染料，”Choi解釋說，“這使我們能夠準確地確定起始材料中活細胞的數(shù)量。”
冷凍是病理學(xué)實驗室的常見做法，同樣面臨著挑戰(zhàn)。
使用傳統(tǒng)的細胞計數(shù)方法時，臺盼藍會低估解凍后的死細胞數(shù)量。
美國德克薩斯州休斯頓衛(wèi)理公會研究所的生物醫(yī)學(xué)工程教授Moonsoo Jin目前正在評估NanoEnTek的一種免疫表型分析儀器。他熱衷于基于熒光的方法提高精度的能力，特別是在經(jīng)歷多次凍融循環(huán)的細胞治療產(chǎn)品中。
“基于熒光的自動化細胞計數(shù)技術(shù)滿足了對細胞準確且快速地計數(shù)，并能獲得細胞治療中需要的細胞活力的相關(guān)數(shù)據(jù)，通常需要在制造和產(chǎn)品發(fā)布過程中多次凍融”，Jin指出，“NanoEnTek的儀器只需要少量樣品，就可以提供準確和快速的細胞數(shù)量和活力結(jié)果。”
這種準確性、高效率和小樣本量的結(jié)合凸顯了基于熒光的細胞計數(shù)技術(shù)在細胞治療中的顯著優(yōu)勢。
 

展望
NanoEnTek擴展了這種基于熒光的技術(shù)，不僅旨在區(qū)分活細胞和死細胞，還要區(qū)分各種類型的免疫細胞。這一進展與用于治療血癌的CAR-T細胞療法（同時使用T細胞和自然殺傷細胞）相關(guān)。正如Park所指出的，其目標是擴展細胞計數(shù)儀的功能，以涵蓋免疫表型分析，以適應(yīng)基于細胞療法不斷變化的需求。
基于這些創(chuàng)新，NanoEnTek開發(fā)了能夠同時處理多達 48 個樣品的自動化的高通量細胞計數(shù)儀——EVE™ HT FL高通量熒光自動細胞計數(shù)儀。此外，與傳統(tǒng)方法相比，它需要的樣本量要少得多。這對于CAR-T細胞療法等研究尤其有利，因為CAR-T細胞療法只有少量可用于各種評估。“NanoEnTek將自動化系統(tǒng)的速度和準確性與熒光染料的特異性結(jié)合在一個設(shè)備中，”Park說，“這有望改善細胞分析，為提高生物醫(yī)學(xué)研究和治療的精度鋪平道路。”
“隨著細胞治療和基因治療的不斷擴展，從血癌擴展到實體瘤，基于熒光的細胞染色方法的應(yīng)用進一步蓬勃發(fā)展，有望在更廣泛的治療環(huán)境中發(fā)揮作用。