將NIR-II熒光探針側(cè)向?qū)游雒庖邆鞲衅饔糜谀[瘤生物標(biāo)志物檢測

本文要點：熒光側(cè)向?qū)游雒庖邷y定（LFA）因其簡單、靈敏和靈活而成為快速篩選各種生物標(biāo)志物的有力工具。值得注意的是，熒光探針主要決定了LFA的分析性能。由于發(fā)射和激發(fā)波長位于可見光區(qū)域，因此大多數(shù)熒光團不可避免地受到光散射和背景自發(fā)熒光的影響。本文報道了一種基于第二種近紅外（NIR-II）熒光探頭的新型LFA傳感器，具有優(yōu)異的抗干擾能力。設(shè)計的NIR-II探頭是Nd3+和 Yb3+摻雜稀土納米顆粒（RENPs），以Nd3+摻雜作為能量供體和 Yb3+作為能量受體，供體-受體能量轉(zhuǎn)移（ET）效率達(dá)到80.7%。同時，依靠聚乳酸-乙醇酸（PLGA）微球?qū)�RENPs的方便有效的包封策略，獲得了表面功能化的NIR-II探針（RE@PLGA），用于后續(xù)生物偶聯(lián)。得益于NIR-II探針的光學(xué)優(yōu)勢，該近紅外LFA在檢測肝細(xì)胞癌（HCC）的重要生物標(biāo)志物α胎蛋白（AFP）方面顯示出良好的線性關(guān)系，范圍為7 ng/mL至200 ng/mL。檢出限（LOD）低至3.0 ng/mL，比臨床臨界值低8.3倍�；�于這種高效RENPs探針的LFA傳感器有望為生物樣品中各種生物標(biāo)志物的高靈敏度檢測提供新的機會。

方案 1.基于高效NIR-II探頭的LFA傳感器設(shè)計方案

在這項工作中，作者設(shè)計并合成了一種基于Nd3+和 Yb3+的高效NIR-II探針REMPs，以 Nd3+作為能量供體和 Yb3+作為能量受體。由于敏化劑離子 Nd3+的高能量轉(zhuǎn)移過程到發(fā)射極離子 Yb3+，該RENPs探針表現(xiàn)出較高的ET效率和背景熒光的抗干擾能力。同時，依靠PLGA微球?qū)�RENPs的方便高效的包封作用，獲得了表面功能化的NIR-II探針（RE@PLGA），用于后續(xù)的生物偶聯(lián)。通過使用RE@PLGA作為熒光報告基因，開發(fā)了一種新型NIR-II LFA傳感器來檢測α胎蛋白（AFP），AFP是診斷肝細(xì)胞癌（HCC）的一種極其重要的生物標(biāo)志物[24]。所提出的NIR-II LFA具有靈敏度高、可靠性好、響應(yīng)快等優(yōu)點。它有望成為POCT的強大技術(shù)，它將進一步體現(xiàn)其在初級保健、快速診斷和大規(guī)模篩查方面的價值。

圖 1.RENPs探針的內(nèi)在ET機制（Yb@Y-Nd70%@Y）

先前的研究表明，它在敏化劑離子Nd3+和發(fā)射極離子 Yb3+之間具有很高的能量轉(zhuǎn)移效率（高達(dá)70%）。本文合成了 Nd3+和 Yb3+摻雜的RENPs進行了一些修改。RENPs的結(jié)構(gòu)示意圖呈現(xiàn)明顯的核殼結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)成分為NaYbF4@NaYF4：Nd70%@ NaYF4（表示為Yb@Y-Nd70%@Y）（圖 1a）。特別是NaYbF4NPs是唯一的活化劑，位于內(nèi)核，可以快速接收來自Nd3+離子的能量。由于 Nd3+離子的吸光系數(shù)高于Yb3+離子，它作為有效的光吸收劑和敏化劑，其摻雜濃度被調(diào)節(jié)在很大的范圍內(nèi)（從30%到95%）。為避免摻雜濃度過高而產(chǎn)生嚴(yán)重的交叉松弛效應(yīng)，最佳摻雜濃度為Nd3+離子（Nd70%）分布在次級外層（NaYF4：Nd70%）。此外，NaYF4在最外層涂覆，以保護內(nèi)部敏化劑和活化劑免受表面淬火。

基于NIR-II探針的LFA原理解釋如下：RENPs（Yb@Y-Nd70%@Y）探針具有高ET效率和優(yōu)越的光學(xué)性能，能夠避免生物樣品的背景干擾，對于實現(xiàn)腫瘤生物標(biāo)志物的高靈敏度和準(zhǔn)確檢測至關(guān)重要。從方案1 開始，將 AFP 包被抗體 （AFP-09） 設(shè)置為測試線（T 線）和 IgG 作為對照線（C 線）分別噴灑在硝酸纖維素 （NC） 膜上。將含有AFP和RE@PLGA-Ab溶液的生物樣品預(yù)混，然后加入檢測卡的樣品孔中，然后加入樣品緩沖液。樣品液體沿試紙飛到NC膜上，形成的免疫復(fù)合物（RE@PLGA-Ab-AFP-10）與AFP包被抗體特異性反應(yīng)，在T線形成夾心結(jié)構(gòu)（RE@PLGA-Ab-AFP-AFP09）。多余的 RE@PLGA-Ab 復(fù)合物與固定在 C 線上的 IgG 非特異性結(jié)合，作為質(zhì)量控制信號。在808 nm激發(fā)光下，NIR-II熒光免疫分析儀分別記錄了T線和C線產(chǎn)生的NIR-II熒光發(fā)射信號（980 nm）。在最佳條件下，980 nm處的AFP濃度和FL強度比值（T/C）呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，為生物樣品中AFP的定量檢測提供了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法。

圖2.基于高效NIR-II熒光探頭的LFA傳感器的分析性能

在最佳條件下，開發(fā)了一種基于高效NIR-II探頭的新型LFA傳感器，用于AFP的測定。隨著AFP濃度的增加，熒光強度比（T/C）逐漸增加。AFP 濃度和 T/C 值在 7.0 ng/mL 至 200 ng/mL （y = 0.0023x + 0.0413， R = 0.9923） 之間顯示出良好的線性關(guān)系（圖2a-2c）。檢測限（LOD）估計為3.0 ng/mL，比臨床臨界值（25 ng/mL）低8.3倍（圖2 d）。此外，與先前報道的檢測方法相比，所提出的NIR-II LFA也表現(xiàn)出良好的靈敏度和相對較寬的線性檢測范圍。

通過分別添加四種腫瘤生物標(biāo)志物（AFP、CEA、PSA 和 CA50）來估計 NIR-II LFA 的特異性。計算交叉反應(yīng)性 （CR） 以評估該方法的特異性。當(dāng)在制備的NIR-II LFA試紙中加入高濃度的腫瘤生物標(biāo)志物（200 ng/mL）時，只有AFP的T/C值較高（0.534）。其他腫瘤生物標(biāo)志物（CEA、PSA、CA50）的T/C值均低于0.02，相應(yīng)的CR也不超過1.5%。結(jié)果表明，這些干擾物質(zhì)對NIR-II LFA的檢測過程影響不大，表現(xiàn)出優(yōu)異的特異性（圖2e）。由于抗體的選擇性識別能力主要決定了方法的特異性，也證明了所制備的NIR-II探針（RE@PLGA-Ab）具有良好的選擇性。

采用化學(xué)發(fā)光免疫測定法（CLIA）作為對照，進一步評估NIR-II LFA的有效性和可靠性。分別通過羅氏 CLIA（線性范圍：0.5-1000 ng/mL）、商業(yè) AFP 試劑盒（線性范圍：10-200 ng/mL，可見熒光檢測）和擬議的 NIR-II LFA 方法（線性范圍：7.0-200 ng/mL）測定的 12 份血清樣品。首先通過SPSS軟件對樣本測試結(jié)果進行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明，無論是NIR-II LFA和CLIA還是VIS LFA和CLIA均無顯著差異（P > 0.05），表明所開發(fā)的用于AFP檢測的NIR-II LFA是可靠的。進一步對3種方法的試驗結(jié)果進行了一致性分析。從圖2f-g可以看出，VIS LFA與CLIA的相關(guān)系數(shù)（R）為0.9989，NIR-II LFA與CLIA的相關(guān)系數(shù)為0.9997。與VIS LFA相比，所開發(fā)的NIR-II LFA與CLIA的吻合性更好，表明所提出的基于高效NIR-II探頭的LFA傳感器在臨床血清樣本中AFP的定量測定中具有更優(yōu)異的準(zhǔn)確度和效度。

綜上所述，我們開發(fā)了一種基于高效NIR-II熒光探針的新型LFA傳感器，用于檢測腫瘤生物標(biāo)志物（AFP作為模型分析物）。所提出的RENPs探針具有三個獨特的優(yōu)勢，為臨床轉(zhuǎn)化提供了廣闊的前景。首先，制備成本低，制備過程可控，便于大規(guī)模生產(chǎn)。其次，敏化劑離子Nd3+和發(fā)射極離子 Yb3+在RENPs內(nèi)部構(gòu)建了一條能量轉(zhuǎn)移高速公路，產(chǎn)生了優(yōu)異的熒光效率。第三，PLGA微球的包封策略容易實現(xiàn)RENPs的表面修飾，有助于生物偶聯(lián);由于NIR-II探頭具有優(yōu)異的抗干擾能力和熒光特性，所提出的NIR-II LFA傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)臨床血清樣本中腫瘤生物標(biāo)志物的無背景檢測，具有良好的靈敏度和寬線性范圍。該LFA傳感器可作為POCT腫瘤生物標(biāo)志物的早期診斷和大規(guī)模篩查的有力工具。

參考文獻

Song, Z.; Hao, Q.; Li, B.; Yuan, Y.; Zhang, S.; Suo, Y.; Han, H.-H.; Cheng, Z., NIR-II fluorescence lateral flow immunosensor based on efficient energy transfer probe for point-of-care testing of tumor biomarkers. Chinese Chemical Letters 2024.

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