分子膠：靶向蛋白降解新星機(jī)制詳解

分子膠是一種小分子降解劑，為攻克蛋白質(zhì)組中約85%的不可成藥靶點(diǎn)帶來了新的機(jī)會(huì)。在這篇文章中，我們將聊一聊分子膠技術(shù)的研究進(jìn)展，展望藥物開發(fā)前景，并舉例說明酶標(biāo)儀對(duì)分子膠研究有何推進(jìn)作用。

分子膠的興起

分子膠是促進(jìn)靶向蛋白質(zhì)與細(xì)胞降解機(jī)制相互作⽤的小分子。通過誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白質(zhì)與泛素連接酶接近，確保目標(biāo)蛋白被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)順利降解（圖1）。

圖1：泛素-蛋白酶體途徑。改編自Zhao et al.

分子膠降解劑能夠影響蛋⽩質(zhì)之間的相互作⽤，為消滅致病蛋⽩開辟了新的治療策略，已成為研究的熱點(diǎn)。從理論上講，這類技術(shù)的潛力是巨大的，為治療癌癥、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病等多種疾病的小分子藥物開發(fā)提供了新的途徑。

傳統(tǒng)的藥物開發(fā)通常側(cè)重于尋找適合蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)的小分子。約有85%不可成藥蛋白質(zhì)缺乏傳統(tǒng)的藥物結(jié)合位點(diǎn)，或進(jìn)入這些位點(diǎn)受到阻礙，而分子膠的出現(xiàn)為打破這些限制提供了機(jī)會(huì)。

與占位驅(qū)動(dòng)型抑制劑相比，分子膠還有其他潛在優(yōu)勢(shì)，如藥效更持久、毒性更小、藥效更高且不易引發(fā)耐藥性。

 

分子膠的“近親”

分子膠和靶向蛋白降解嵌合體（PROteolysis TArgeting Chimeras, PROTACs）都是靶向蛋白質(zhì)降解劑。PROTACs也是誘導(dǎo)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的降解。PROTAC由兩個(gè)獨(dú)立的分子組成，通過連接分子結(jié)合在一起，形成一個(gè)雙功能分子，兩端分別與目標(biāo)蛋白和E3泛素連接酶結(jié)合（圖2）。而分子膠結(jié)構(gòu)更為簡(jiǎn)單，與連接酶（最常見）或目標(biāo)蛋白相互作⽤。由于沒有連接分子，分子膠的分子量較小，因此與PROTACs相比，分子膠有更好的細(xì)胞滲透性和生物利用率。

圖2：分子膠和PROTAC的功能示意圖。(a) PROTAC同時(shí)與目標(biāo)蛋白和E3泛素連接酶結(jié)合。(b) 分子膠通過與E3泛素連接酶（圖中所示）或目標(biāo)蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白與E3泛素連接酶之間的相互作⽤。在這兩種情況下，靶向蛋白質(zhì)都會(huì)被多泛素化并降解。

 

分子膠研究進(jìn)展

沙利度胺、來那度胺和泊馬度胺（免疫調(diào)節(jié)劑，IMiD）都屬于誘導(dǎo)靶向蛋白質(zhì)降解的分子膠藥物。這幾種降解劑都是將目標(biāo)蛋白質(zhì)與cereblon接近，后者是目前應(yīng)用最廣的E3泛素連接酶。 

還有一些分子膠也在臨床開發(fā)中。CC-220、CC-92480和CC-90009正處于II期試驗(yàn)階段，用于治療不同的適應(yīng)癥，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性骨髓瘤和急性髓性白血病。

同時(shí)，分子膠領(lǐng)域的新發(fā)現(xiàn)促使人們對(duì)這種解劑技術(shù)的關(guān)注日益高漲。迄今為止，大多數(shù)分子膠是偶然發(fā)現(xiàn)的。PROTACs的發(fā)展是由連接分子和“彈頭”的設(shè)計(jì)原理推動(dòng)的，但有效膠的分子特征在很大程度上仍是未知。對(duì)分子膠工作原理的不斷了解，將促進(jìn)合理設(shè)計(jì)的可行性。

 

新突破：分子內(nèi)二價(jià)降解劑

大多數(shù)分子膠是在一個(gè)接觸點(diǎn)上與連接酶（最常見）或目標(biāo)蛋白結(jié)合。近期有一類新的分子膠被發(fā)現(xiàn)，這種降解劑可在兩處與目標(biāo)蛋白結(jié)合。通過對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)、降解劑和連接酶形成的三元復(fù)合物的研究，指導(dǎo)低皮摩爾效力的改良降解劑的合理設(shè)計(jì)。

英國(guó)鄧迪大學(xué)和奧地利科學(xué)院CeMM分子醫(yī)學(xué)研究中心的研究人員在《Nature》上發(fā)表了一項(xiàng)名為“Targeted protein degradation via intramolecular bivalent glue”的研究。

研究的一個(gè)關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是，降解劑在兩個(gè)接觸點(diǎn)上的結(jié)合，使目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)重排。這種重排穩(wěn)定了目標(biāo)蛋白與E3連接酶的相互作⽤，對(duì)靶向降解至關(guān)重要。

在研究中，HiBiT降解測(cè)定法用于評(píng)估三種不同分子膠降解劑的降解效力和可能的最大降解水平，使用的是Promega的“Nano-Glo® HiBiT裂解檢測(cè)系統(tǒng)”，分析儀器是BMG LABTECH的PHERAstar® FSX。 研究中使用的降解劑（IBGs 1-3）靶向與癌癥和炎癥有關(guān)的含溴結(jié)構(gòu)域蛋白BRD2和BRD4（圖3）。這項(xiàng)研究開辟了一個(gè)新的探索領(lǐng)域，即蛋白質(zhì)降解劑通過順式橋接蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域來增強(qiáng)與E3連接酶的表面互補(bǔ)性，從而實(shí)現(xiàn)有效的泛素化和降解。

圖3 ：HiBiT降解檢測(cè)。用分子膠降解劑IBG1、IBG2和IBG3處理HEK293 HiBiT敲入細(xì)胞 5小時(shí)，通過HiBiT裂解檢測(cè)系統(tǒng)量化BRD2-、BRD3-和BRD4-HiBiT蛋白的水平。數(shù)據(jù)、n=3獨(dú)立實(shí)驗(yàn)、平均值+/-S.D. 改編自Hsia et al.

 

分子膠未來發(fā)展方向

分子膠的合理設(shè)計(jì)仍處于起步階段，但對(duì)于希望將人工智能指導(dǎo)的方法與已知分子膠結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)相結(jié)合的前沿企業(yè)來說，這顯然是一個(gè)值得關(guān)注的領(lǐng)域。研究重點(diǎn)是進(jìn)一步了解蛋白降解標(biāo)簽（degrons），即蛋白質(zhì)上作為泛素連接酶識(shí)別信號(hào)的序列。

目前使用的許多分子膠標(biāo)簽較大，無法標(biāo)記編碼細(xì)胞原生蛋白的基因，或者作用范圍太廣，超出了目標(biāo)蛋白的范圍。為了打破這種局限，麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)布羅德研究所的研究人員開發(fā)了一種名為PACE的持續(xù)進(jìn)化平臺(tái)，可以生成較小的蛋白降解標(biāo)簽，形成的分子膠復(fù)合物具有觸發(fā)靶向蛋白降解所需的特異性。較小的降解標(biāo)簽通過質(zhì)粒編輯被導(dǎo)入細(xì)胞基因組，并在其中募集泛素連接酶cereblon。PACE平臺(tái)可用于開發(fā)具有新型降解標(biāo)簽的分子膠復(fù)合物。

對(duì)新泛素連接酶的尋找也在進(jìn)行中。在目前的分子膠研究領(lǐng)域，cereblon仍是使用最廣泛的。目前人體中已知的E3泛素連接酶有600多種。其中一些對(duì)特定細(xì)胞類型具有特異性，有望成為克服分子膠脫靶效應(yīng)的重要一步。

大多數(shù)分子膠降解劑靶向細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，但靶向細(xì)胞外和膜結(jié)合蛋白質(zhì)的機(jī)會(huì)也是存在的。我們?cè)谶@篇文章中探討了其他新興降解技術(shù)，包括利用溶酶體降解途徑的技術(shù)。

 

 

分子膠有望為癌癥、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病等多種疾病帶來新的治療機(jī)會(huì)。分子膠藥物的潛力與多種疾病相關(guān)的非酶蛋白有密切聯(lián)系，在這方面，傳統(tǒng)的小分子抑制劑與活性位點(diǎn)結(jié)合已被證明是無效的。像這樣的新方法將為未來小分子藥物的發(fā)現(xiàn)、開發(fā)、高通量篩選、臨床前測(cè)試、臨床試驗(yàn)以及最終轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用帶來令人期待的機(jī)會(huì)。

 

酶標(biāo)儀如何促進(jìn)分子膠研究

酶標(biāo)儀是研究分子膠的多功能工具，可用于評(píng)估分子膠介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解效果。而且分子膠候選物的篩選通常需要高通量檢測(cè)能力，這正是先進(jìn)酶標(biāo)儀的強(qiáng)項(xiàng)。

化學(xué)發(fā)光及其衍生技術(shù)是研究分子膠蛋白-配體結(jié)合的有力工具。NanoBRET™和HiBiT技術(shù)用于測(cè)量活細(xì)胞中的結(jié)合和泛素化。配備孵育和大氣控制功能的酶標(biāo)儀能夠進(jìn)一步增強(qiáng)這一功能。CLARIOstar® Plus酶標(biāo)儀可支持長(zhǎng)期動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)的運(yùn)行，同時(shí)保持細(xì)胞的生理環(huán)境。圖4展示了在CLARIOstar® Plus上使用NanoBRET進(jìn)行泛素化分析的示例。

圖4：NanoBRET™ 泛素化分析結(jié)果。
 

熒光偏振測(cè)定法也可用于研究分子膠與其靶蛋白的結(jié)合活性以及相互作用的動(dòng)力學(xué)�？梢詼y(cè)量熒光標(biāo)記的分子膠與靶蛋白結(jié)合后引起的熒光偏振變化，提供有關(guān)靶向蛋白質(zhì)和降解劑之間的結(jié)合強(qiáng)度和相互作用動(dòng)力學(xué)的信息。 

 

應(yīng)用說明 “實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)泛素化：基于熒光偏振的方法UbiReal”介紹了一種熒光偏振方法，可用于實(shí)時(shí)跟蹤泛素連接和解連接的各個(gè)階段。該方法適用于高通量分析，利用熒光偏振技術(shù)測(cè)量熒光標(biāo)記的泛素。使用UbiReal可以監(jiān)測(cè)泛素化周期的所有階段（圖5）。點(diǎn)擊文末“閱讀原文”，可查看詳情。

圖5：UbiReal檢測(cè)原理

酶標(biāo)儀還可用于評(píng)估分子膠介導(dǎo)的蛋⽩質(zhì)降解中涉及的蛋⽩質(zhì)相互作⽤。AlphaScreen®、時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）等技術(shù)或NanoBRET™等化學(xué)發(fā)光方法，可支持在微孔板中測(cè)量靶標(biāo)與連接酶之間的相互作⽤。

 

另外，高通量篩選技術(shù)可用于優(yōu)先篩選潛在的分子膠降解劑，而酶標(biāo)儀是一種可根據(jù)篩選需要進(jìn)行擴(kuò)展的有用工具。

BMG LABTECH提供一系列涵蓋吸收光、熒光和化學(xué)發(fā)光測(cè)量的靈敏檢測(cè)設(shè)備。那么對(duì)于與分子膠研究相關(guān)的特定需求和應(yīng)用，哪種酶標(biāo)儀更適合？

其中PHERAstar FSX專為篩選而設(shè)計(jì)，在降解劑研究中，是高性能高通量檢測(cè)的理想酶標(biāo)儀。

VANTAstar®和CLARIOstar Plus均支持波長(zhǎng)掃描，并采用動(dòng)態(tài)范圍擴(kuò)展技術(shù)，單次運(yùn)行即可提供高質(zhì)量數(shù)據(jù)。配備線性可變?yōu)V光片光柵TM和多種濾光片選擇，可提高透光率和靈敏度。對(duì)于活細(xì)胞檢測(cè)，還可配備大氣控制單元。

BMG LABTECH的酶標(biāo)儀都具有超快的讀取能力。Omega系列、CLARIOstar Plus和PHERAstar FSX酶標(biāo)儀還配有移液裝置，可在移液的同時(shí)發(fā)揮最優(yōu)探測(cè)能力。

這些多功能酶標(biāo)儀將高性能、小反應(yīng)體系、測(cè)量時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，可大大節(jié)省試驗(yàn)材料等資源。

 

 

轉(zhuǎn)載自：BMG LABTECH

 

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