利用代謝流揭示TANGO6調(diào)控造血干細(xì)胞擴增的分子機制

研究背景

造血干細(xì)胞（HSCs）的增殖異常會導(dǎo)致白血病、貧血、免疫缺陷等疾病的發(fā)生。通過促進(jìn)HSCs增殖獲取足夠HSCs進(jìn)行血液移植是治療血液系統(tǒng)疾�。ò籽�病等）的關(guān)鍵。已知細(xì)胞增殖與聚合酶II介導(dǎo)的mRNA轉(zhuǎn)錄以及囊泡轉(zhuǎn)運有關(guān)，但RNA聚合酶II各個亞基的入核機制仍不清楚，且囊泡轉(zhuǎn)運驅(qū)動HSCs增殖的分子機理仍值得深入探究。

研究概述

2024年3月，中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院、西南大學(xué)李禮課題組和羅凌飛課題組在Nature Communications雜志上發(fā)表了題為“TANGO6 regulates cell proliferation via COPI vesicle-mediated RPB2 nuclear entry”的文章。該研究綜合利用細(xì)胞系以及小鼠等模型，揭示轉(zhuǎn)運和高爾基體組織—TANGO6通過外殼蛋白復(fù)合物I（COPI）囊泡轉(zhuǎn)運調(diào)控RNA聚合酶II亞基—RPB2入核驅(qū)動細(xì)胞增殖這一新機制，并強調(diào)了其在促進(jìn)HSCs增殖中的重要作用。（麥特繪譜提供[2,3-13C2]標(biāo)記的丙氨酸代謝流檢測技術(shù)）

技術(shù)路線圖

研究結(jié)果

1. TANGO6亞細(xì)胞定位和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)鑒定

基于HeLa細(xì)胞探究COPI囊泡在整個細(xì)胞周期中的調(diào)節(jié)機制，發(fā)現(xiàn)高爾基體衍生的COPI囊泡是細(xì)胞質(zhì)中TANGO6的關(guān)鍵載體，并且在細(xì)胞周期進(jìn)程中動態(tài)分布。隨后研究COPI囊泡轉(zhuǎn)運TANGO6的機制，借助不同數(shù)據(jù)庫分析TANGO6的氨基酸序列，預(yù)測了6個推定的跨膜結(jié)構(gòu)域和一個信號錨點。進(jìn)一步通過實驗證實TANGO6的N端以及C端均定位在細(xì)胞漿中，通過一個信號錨以及兩個跨膜結(jié)構(gòu)域錨定在COPI囊泡上，從而隨著COPI囊泡運動。

免疫熒光染色圖像表明TANGO6 WT和TANGO6 KO細(xì)胞都含有丙氨酸。基于[2，3-13C2]標(biāo)記丙氨酸的代謝流分析（麥特繪譜提供服務(wù)）結(jié)果顯示，丙氨酸水平在WT細(xì)胞沉淀中逐漸減少，在TANGO6 KO細(xì)胞沉淀中以更快速率下降，暗示TANGO6參與蛋白質(zhì)分泌。

圖1. COPI囊泡中TANGO6的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

2. TANGO6通過COPI-SNARE-ER通路進(jìn)入細(xì)胞核

除了TANGO6在細(xì)胞質(zhì)中的動態(tài)分布外，在細(xì)胞核中也觀察到TANGO6信號。已知可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（SNARE）復(fù)合物介導(dǎo)的膜融合在貨物通過COPI囊泡從高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）的逆向運輸中起著至關(guān)重要的作用，Co-IP結(jié)果表明，TANGO6與N-乙基馬來酰亞胺敏感融合蛋白（NSF，一種參與SNARE復(fù)合物介導(dǎo)膜融合的關(guān)鍵ATP酶）相互作用，提示COPI-SNARE-ER通路參與了TANGO6的入核。

Co-IP結(jié)果表明，TANGO6和富含亮氨酸的重復(fù)序列59（LRRC59）之間存在強大的相互作用。敲低KPNB1導(dǎo)致細(xì)胞核中TANGO6信號急劇減少，并伴隨TANGO6在細(xì)胞質(zhì)中的積累結(jié)合。結(jié)合siRNA干擾技術(shù)結(jié)果，最終明確TANGO6經(jīng)COPI囊泡轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，通過SNARE復(fù)合體介導(dǎo)的膜融合進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并在LRRC59和KPNB1的幫助下進(jìn)入細(xì)胞核。

圖2. TANGO6的入核由SNARE復(fù)合體、ER和KPNB1輔助

3. TANGO6可攜帶RPB2到細(xì)胞核

TANGO6不與染色質(zhì)結(jié)合，推測其可能參與了各種因子向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運，因此對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251進(jìn)行質(zhì)譜分析以鑒定候選分子。結(jié)果表明，RNA聚合酶II復(fù)合物的第二大亞基—RPB2與TANGO6表現(xiàn)出實質(zhì)性的相互作用，隨后的Co-IP實驗證實了HeLa和U251細(xì)胞中TANGO6和RPB2之間的強相互作用。進(jìn)一步，敲降TANGO6后發(fā)現(xiàn)RPB2累積在細(xì)胞漿中，無法入核。并隨后證實了TANGO6通過COPI囊泡介導(dǎo)的運輸將RPB2轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核，并得到了來自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的KPNB1的協(xié)助，整體表明TANGO6-RPB2軸在細(xì)胞增殖中起著不可或缺的作用。

圖3. TANGO6可攜帶RPB2到細(xì)胞核

4. TANGO6-RPB2軸在造血過程中被HSC廣泛使用

繼續(xù)探索TANGO6-RPB2軸在體內(nèi)的作用。建立傳統(tǒng)的Tango6敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠HSCs的產(chǎn)生不受影響，但在HSCs的增殖期（E12.5-E16.5）cKO小鼠通體變白，胎肝變小無血色。通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)HSCs的數(shù)量在突變體中顯著降低，且Tango6缺陷會影響小鼠HSCs中RPB2入核受阻，而過表達(dá)Tango6后HSCs數(shù)目增加，表明TANGO6-RPB2信號軸在生物體內(nèi)的重要功能之一是調(diào)控HSCs的增殖。

圖4. TANGO6-RPB2軸對小鼠造血干細(xì)胞在體內(nèi)的擴增至關(guān)重要

研究結(jié)論

本研究基于細(xì)胞系及小鼠等模型，以TANGO6為切入點，運用Co-IP、流式細(xì)胞術(shù)、同位素標(biāo)記的代謝流等方法，揭示了RNA聚合酶II亞基的入核機制與TANGO6、RPB2和COPI囊泡轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的協(xié)同作用緊密協(xié)調(diào)有關(guān)。COPI囊泡相關(guān)的TANGO6通過逆行轉(zhuǎn)運將RPB2攜帶到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在LRRC59和輸入蛋白的幫助下攜帶到細(xì)胞核，以確保細(xì)胞增殖過程中的順利進(jìn)展。此項研究為實現(xiàn)有效在體外擴增干細(xì)胞或并將其作為潛在治療靶點來緩解和治療腫瘤提供理論指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)

Feng Z, Liu S, Su M, et al. TANGO6 regulates cell proliferation via COPI vesicle-mediated RPB2 nuclear entry. Nature Communications. 2024.

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