骨肉瘤基氧化物納米平臺用于NIR-II熒光/磁共振雙模成像及免疫治療

本文要點：骨肉瘤是一種致命的骨腫瘤，多發(fā)于兒童和青少年，具有局部破壞性和高轉(zhuǎn)移性。迫切需要針對骨肉瘤具有高治療效果和精確診斷的獨特納米平臺。多模態(tài)光學成像和程序化治療，包括協(xié)同光熱-化學動力學治療 (PTT-CDT) 引發(fā)免疫遺傳性細胞死亡 (ICD) 是一種有前途的策略，它具有高生物成像靈敏度，可準確描繪骨肉瘤，治療效果顯著，副作用可忽略不計。

 

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方案1. 骨肉瘤靶向mCu&Ce@ICG/RGD的構(gòu)建過程示意圖，用于NIR-II熒光/MR生物成像和PTT-CDT-ICD協(xié)同腫瘤抑制

 

本文開發(fā)了一種簡便的一步法合成具有介孔納米結(jié)構(gòu)的多功能 Cu&Ce 氧化物納米球 (mCu&Ce)。據(jù)報道，在 ICG 封裝和 RGD 肽表面接枝(mCu&Ce@ICG/RGD) 后，該納米平臺可準確識別骨肉瘤并在腫瘤微環(huán)境 (pH = 6.5) 下觸發(fā) ICG、Cu 和 Ce 離子的劇烈釋放（方案1）。進入骨肉瘤腫瘤細胞后，mCu&Ce@ICG/RGD 可在近紅外激光照射下有效產(chǎn)生高溫并進而促進•OH 的生成。PTT/CDT 協(xié)同腫瘤消融將在體外和體內(nèi)實現(xiàn)。同時，熱量和擴增的 ROS 都通過激發(fā) ICD 來激活有效的 T 細胞生成，從而產(chǎn)生全身抗骨肉瘤免疫反應(yīng)，從而顯著介導有效的腫瘤免疫治療。此外，基于Cu&Ce 的納米平臺可以通過 NIR-II 熒光和磁共振雙模生物成像對骨肉瘤進行精確的早期診斷�？傊�，本研究設(shè)計了一種具有雙模生物成像特性的簡便的 Cu&Ce 納米平臺。它可以特異性地識別骨肉瘤，并通過 PTT 增強的 CDT 實現(xiàn)癌細胞抑制，從而進一步顯著誘導 ICD 增強。

圖1. mCu&Ce@ICG/RGD 的表征

 

mCu&Ce@ICG/RGD納米平臺的制備具體流程如圖1所示。首先以氯化銅（CuCl 2）和氯化鈰（CeCl 3）為前驅(qū)體（重量比=7:3）在水相體系中首次制備出親水性的mCu&Ce納米粒子，在90°C下攪拌均勻后，加入烏洛托品不同時間后可得到一系列表面粗糙的合金化Cu&Ce納米球。進一步臨床熒光團ICG負載到中孔納米結(jié)構(gòu)中（mCe&Cu@ICG），負載效率約為12.5  %（w/w）。接下來，為了延長血液循環(huán)時間并進行隨后的靶向修飾，將親水性PEG 2000 -NH 2包裹在mCe&Cu@ICG的界面上。最后，通過脫水縮合反應(yīng)將活性骨肉瘤識別配體RGD交聯(lián)在ICG負載的雙金屬納米粒子的外層（mCe&Cu@ICG/RGD）。令人興奮的是，表面接枝RGD后ζ電位明顯降低，這可歸因于-NH2基團的消耗。在mCe&Cu@ICG/RGD中發(fā)現(xiàn)不明顯的形態(tài)轉(zhuǎn)變和尺寸變化（圖 1L）。同時，與ICG類似，ICG封裝納米平臺的發(fā)射光譜理想地延伸到NIR-II，并且上述兩個樣品的非峰值NIR-II發(fā)光圖像非常強，證明了mCe&Cu@ICG/RGD的成功設(shè)計（圖 1 P）

圖2. pH 敏感生物降解、ROS 生成和高溫測定

 

由于mCe&Cu@ICG/RGD是為了激活I(lǐng)CG的釋放而設(shè)計的，因此在細胞外弱酸誘發(fā)下，mCe&Cu基框架生物降解發(fā)生了類Fenton反應(yīng)。在pH=6.5條件處理下的生物降解效率在所有時間點都明顯高于pH=7.4組，6h時框架初步崩潰，納米顆粒釋放，36h時所有納米球消失，出現(xiàn)大量Cu&Ce基顆粒。這些納米顆粒能夠傳導腫瘤組織浸潤。在腫瘤組織中細胞外弱酸性pH值浸泡36小時后，mCe&Cu@ICG/RGD的平均直徑從∼68nm急劇下降到 ∼5nm ， 進一步表明結(jié)構(gòu)整體崩解。同時，在不同的孵育期內(nèi)還測定了pH=6.5生理緩沖液上清液中ICG的釋放曲線。我們觀察到ICG染料以時間依賴性方式逐漸釋放（圖2C）。同時，如pH=6.5條件下釋放的游離ICG的NIR-II發(fā)光圖像所示，熒光信號在36小時內(nèi)顯著增強，明顯強于pH=7.4組（圖 2D）。同時，在腫瘤微環(huán)境刺激緩沖液孵育不同時間后，Cu和Ce離子的釋放趨勢相似，孵育36h后約有90%的Cu/Ce離子被釋放。同時，在弱酸性環(huán)境下處理36h后，以商業(yè)•OH指示劑3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）評價Cu&Ce離子的類Fenton催化效果。在•OH催化下，產(chǎn)物氧化物TMB具有三個特征峰，顯然，與mCe&Cu@ICG/RGD + L基團相比，mCu@ICG/RGD僅表現(xiàn)出邊際ROS生成率，正如預期的那樣，mCe&Cu@ICG/RGD + H2O2 + L 的•OH 增加量增加了 2 倍。納米平臺在高 H2O2條件下加上 808 nm 光照射時增強的化學動力學能力（圖 2E）。隨后，由于 ICG 對 808 nm 激光的強吸收賦予 mCe&Cu@ICG/RGD 強大的光熱轉(zhuǎn)換性能。如圖 2F、G 所示，納米平臺的溫度呈現(xiàn)出明顯的時間相關(guān)上升趨勢，在連續(xù) 300 秒的 808 nm 激光照射下溫度上升到最高水平（79.1 °C），證明了快速的近紅外光響應(yīng)。與此形成鮮明對比的是，在相同處理下，PBS 溶液中的溫度略有上升，在激光照射終點僅為 36.3 °C。此外，為了進一步檢測激光-熱轉(zhuǎn)換效率（η），最近從冷卻-加熱循環(huán)計算了分散在水溶液中的mCe&Cu@ICG/RGD的熱量差異（圖 2H），具體的η值大約為∼55.92  %（圖2I）同時，在四次808nm激光開關(guān)循環(huán)后也監(jiān)測到出色的光熱穩(wěn)定性（圖 2J）�？傮w而言，所有結(jié)果證實了負載ICG的腫瘤響應(yīng)性程序化介孔Cu&Ce納米載體可進一步應(yīng)用于通過PTT-CDT抑制惡性腫瘤。

圖3. PTT -CDT體外細胞殺傷及 ICD 指標的表達

 

如圖 3A所示，用RGD修飾的納米平臺處理的ICG的紅光明顯強于mCe&Cu@ICG和游離ICG。如圖 3B 所示 ，與 mCu&Ce@ICG/RGD 組相比，mCu@ICG/RGD 組呈現(xiàn)出暗綠色熒光，這可以歸因于前者的生物降解率低。在 pH = 6.5 的緩沖液中孵育 36 小時后，發(fā)現(xiàn)從 mCu 納米葉中釋放出的 Cu 離子相對較少，且含有大量 Cu 基碎片。值得注意的是，與本體溶液中的 ROS 生成趨勢一致，當使用 808 nm 光照射并伴隨 H2O2預處理時，該趨勢會顯著加強（圖3G）。研究結(jié)果表明，更高的熱量產(chǎn)生可以顯著增強類 Fenton 反應(yīng)，因為 ROS 增強的結(jié)果凸顯了我們研究的重要性。

如圖 3D所示，與其他制劑相比，用 mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2+ L處理的 143b 和 b 細胞 介導了最高水平的 CRT，這與細胞內(nèi) ROS 擴增結(jié)果一致。此外，該組中還顯示出 HMGB1 信號減弱，CRT 水平的這種相反趨勢進一步證明了我們的納米平臺增強的 ICD 效應(yīng)（圖 3D）。隨后，為了進一步說明 ICD 相關(guān)蛋白的表達，通過蛋白質(zhì)印跡分析研究了各種處理后 143b 中的 CRT 和 HMGB1 水平。顯然，當用 mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2 + L 處理 143b 細胞時，CRT 在細胞膜上顯著上調(diào)，而 HMGB1 在細胞質(zhì)中顯著下調(diào) （圖 3E 、F）。與mCu&Ce@ICG/RGD 組相比，mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2+ L中上述表達的蛋白質(zhì)水平分別大約高出 2 倍和降低 5 倍 （圖 3I、J），揭示了該處理強大的 ICD激發(fā)能力。最后，分別用CLSM和流式細胞儀獲得活死染色圖像和細胞凋亡-壞死研究。與細胞內(nèi)ROS生成和HMGB1的結(jié)果類似，143b細胞在mCu&Ce@ICG/RGD + H2O2+ L中經(jīng)歷最有效的細胞死亡 （圖 3K -N）。正如預期的那樣，當mCu&Ce@ICG/RGD的濃度增加到300µg / mL時，H2O2預孵育加激光照射組中143b細胞的細胞活力僅為純納米平臺處理組的一半。這種最高的腫瘤細胞殺傷力主要由PTT同時擴增的ROS和ICD介導。

圖4. 通過熒光成像、MRI 和光熱評估進行體內(nèi)腫瘤靶向性評估

 

之后，研究mCu&Ce@ICG/RGD在骨肉瘤荷瘤裸鼠模型中的生物分布和腫瘤富集行為。首先，為了獲得準確的腫瘤輪廓辨別，將mCu@ICG/RGD和mCu&Ce@ICG/RGD分別靜脈注射到荷瘤小鼠皮下，隨后在特定時間拍攝NIR-II熒光生物圖像，通過小動物NIR-II熒光成像生物系統(tǒng)監(jiān)測該納米平臺在體內(nèi)的腫瘤靶向性和生物分布。顯然，在注射mCu&Ce@ICG/RGD后2 h，腫瘤輪廓逐漸清晰，熒光信號（超過1000 nm）最初集中在腫瘤部位，24 h時達最強，腫瘤輪廓與周圍外周肌肉組織明顯區(qū)分開來；隨后，它隨著時間的推移而緩慢衰減，殘留納米平臺保持在48小時（圖 4 A）。而mCu@ICG/RGD的熒光信號主要分散在肝臟中，并且在所有時間間隔內(nèi)都明顯高于mCu&Ce@ICG/RGD組�；�于在肝臟中的這種高積累，后一組的腫瘤組織幾乎無法區(qū)分（圖 4 A）。同時，收獲腫瘤和主要器官進行離體NIR-II熒光生物成像。值得注意的是，即使可以看到上述兩組腫瘤中的比較光信號強度，mCu&Ce@ICG/RGD處理的肝臟的強度明顯低于mCu@ICG/RGD（圖 4 B）。此處，前者相對快速的生物降解行為有利于肝臟清除。因此，腫瘤與周圍正常組織的比例通過半定量平均NIR-II信號強度來計算。mCu&Ce@ICG/RGD 在注射后 24 小時的數(shù)值比 mCu@ICG/RGD 高 6 倍（圖 4D）。此外，本文還通過MRI 驗證了Cu 基納米平臺對腫瘤的特異性識別，以臨床Gd-DTPA 為對照。根據(jù)不同時間間隔的連續(xù) T1WI MRI 生物圖像，足底注射 mCu&Ce@ICG/RGD 的淋巴轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的 MRI 信號在注射后 24 小時急劇增加至峰值水平，從此時間點開始逐漸衰減至基礎(chǔ)強度（圖 4C）。然而，由于 Gd-DTPA 的快速排泄，可以在注射后 2 小時發(fā)現(xiàn)最高的腫瘤積累。我們的納米平臺在 24 小時的腫瘤與組織比明顯高于 Gd-DTPA（圖 4E），進一步證明了mCu&Ce@ICG/RGD有效的腫瘤靶向能力，此時最合適進行激光照射進行PTT。最后，研究了皮下骨肉瘤小鼠尾靜脈注射PBS、mCu&Ce@ICG和mCu&Ce@ICG/RGD后在體內(nèi)的光熱轉(zhuǎn)換效果。具體而言，納米制劑處理的腫瘤部位溫度急劇變化，升高到峰值（分別為48.9和52.8°C），并且最大光熱維持率（圖 4F，G）。毫無疑問，這種現(xiàn)象主要歸因于RGD修飾的主動靶向能力。對于PBS處理的小鼠，即使經(jīng)過300秒的照射，溫度也僅略有升高（39.8°C）（圖 4F，G）。因此，上述體內(nèi)生物成像結(jié)果凸顯了多模對比納米劑在腫瘤診斷方面的潛力和令人滿意的腫瘤抑制熱療性能。

圖5.  體內(nèi) PTT CDT 和 ICD 評估

 

基于上述基于Cu&Ce的納米平臺在體外具有良好的細胞殺傷力和出色的腫瘤蓄積效果，我們建立了143b腫瘤異種移植小鼠模型，以進一步研究mCu&Ce@ICG/RGD在體內(nèi)的PTT/CDT/ICD協(xié)同治療效果。為了驗證我們的程序化治療假設(shè)，給皮下患有骨肉瘤的小鼠施用六種不同的配方（PBS、L、mCu@ICG/RGD、mCu&Ce@ICG/RGD、mCu@ICG/RGD + L和mCu&Ce@ICG/RGD + L）。如圖 5A -D所示，接受PBS或激光治療的小鼠的腫瘤組織在整個治療過程中迅速生長，證實單獨使用808nm激光（ 5分鐘，1.5W/cm2 ）對腫瘤生長幾乎沒有抑制作用。不出所料，與具有部分消融效果的 mCu@ICG/RGD 相比，由于生物降解速度更快，用mCu&Ce@ICG/RGD 處理的腫瘤生長抑制率相對較高，相比之下，納米粒子加激光照射組的腫瘤體積和腫瘤重量均得到明顯控制。有趣的是，與其他組相比，mCu&Ce@ICG/RGD + L 給藥的腫瘤基本被抑制，腫瘤抑制率明顯較低。顯然，這種徹底的根除效率可能歸因于協(xié)同 PTT 增強的 ROS 擴增。結(jié)果顯示，激光照射后給予mCu&Ce@ICG/RGD可顯著延長小鼠壽命，超過90%的治愈小鼠存活超過100天，而接受PBS治療的小鼠均在42天內(nèi)死亡（圖 5E），充分表明我們基于Cu&Ce的PTT-CDT協(xié)同療法具有最佳的腫瘤抑制性能。
 
總之，本文設(shè)計并成功制備了一個迷人的納米平臺，該平臺由用于 CDT 和 MRI 的介孔Cu&Ce 氧化物納米球、用于 NIR-II 造影劑和PTT 的負載 ICG 以及用于靶向基序的 RGD 組成。這種有前途的納米治療劑具有無與倫比的優(yōu)勢，例如對骨肉瘤組織的精確識別、用于腫瘤輪廓區(qū)分的 NIR-II 熒光生物成像和 MRI 以及通過 PTT 評估的 CDT 和激活的ICD 進行的程序化抗癌性能。通過在體外有效誘導癌細胞死亡以及在體內(nèi)強力根除實體骨肉瘤并顯著延長存活率來證實治療效果。此外，出色的生物安全性能也在體內(nèi)得到體現(xiàn)。該研究為促進臨床惡性腫瘤的靶向診斷和治療開發(fā)了一種獨特的范例。

 

參考文獻

heng, M., Kong, Q., Tian, Q. et al. Osteosarcoma-targeted Cu and Ce based oxide nanoplatform for NIR-II fluorescence/magnetic resonance dual-mode imaging and ros cascade amplification along with immunotherapy. J Nanobiotechnol 22, 151 (2024).

 

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