單細胞腦類器官篩選用于鑒定自閉癥的發(fā)育缺陷

文章詳情

文章標題：Single-cell brain organoid screening identifies developmental defects in autism
中文標題：單細胞腦類器官篩選用于鑒定自閉癥的發(fā)育缺陷
期刊：Nature
IF：50.5
研究機構(gòu)：奧地利科學院分子生物技術(shù)研究所（IMBA）
doi: 10.1038/s41586-023-06473-y

01 簡介

人類大腦的發(fā)育涉及許多獨特且復雜的過程，這些過程在其他許多物種中都未曾見到。這些過程可能導致神經(jīng)發(fā)育障礙（Neurodevelopmental disorder, NDD），如自閉癥譜系障礙（ASD）。ASD的檢測只能在發(fā)育成熟的大腦中實現(xiàn)。腦類器官作為一種類大腦的三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，提供了在體外研究人類大腦發(fā)育的可能性。雖然腦類器官可以用來在人體環(huán)境中研究神經(jīng)發(fā)育障礙，但也受到變異性和低通量的限制。本文介紹了一種結(jié)合了類器官、基因編輯及單細胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的新系統(tǒng)，用于研究ASD相關(guān)基因?qū)�細胞命運決定和發(fā)育階段的影響。

研究者開發(fā)了CRISPR-human organoids-scRNA-seq（CHOOSE）系統(tǒng)，這個系統(tǒng)結(jié)合了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和單細胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，用于高效篩選和分析與ASD相關(guān)的基因。使用已驗證的gRNA對和可誘導的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在類器官中進行基因敲除篩選，可以使類器官中的每個細胞最多攜帶一個特定ASD基因的突變。利用單細胞多組學數(shù)據(jù)，包括轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性構(gòu)建類器官的發(fā)育基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在單細胞水平上追蹤每個突變的影響。隨后，研究了36個與ASD相關(guān)的高風險基因?qū)�細胞類型和發(fā)育軌跡的影響。

02 技術(shù)路線

1、類器官生成
使用人類胚胎干細胞（hESCs）生成類器官，確保類器官中存在豐富的端腦組織。

2、gRNA設(shè)計和驗證
針對每個目標基因設(shè)計一對引導RNA（gRNA），選擇與自閉癥譜系障礙（ASD）相關(guān)的高風險基因。這些基因與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和發(fā)育過程相關(guān)，具有研究價值。

3、構(gòu)建CRISPR載體
使用誘導型CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將gRNA和Cas9基因構(gòu)建到同一個載體中。這種系統(tǒng)可以通過加入誘導劑（如四環(huán)素）激活Cas9的表達，從而控制基因敲除的時間和空間。將CRISPR載體轉(zhuǎn)染入hESCs，通過抗性篩選和流式細胞術(shù)確定成功轉(zhuǎn)染的細胞克隆。

4、克隆條形碼標記
為每個dual-sgRNA cassette引入克隆條形碼，以標記各個細胞的遺傳操作。這些條形碼在單細胞測序中用于追蹤每個細胞的遺傳背景。通過PCR和測序驗證條形碼的獨特性，確保每個細胞克隆都可以被準確識別來驗證條形碼的獨特性和穩(wěn)定性。

5、單細胞RNA測序（scRNA-seq）
將類器官解離成單細胞懸液，使用10x Genomics Chromium系統(tǒng)進行單細胞捕獲和cDNA合成。構(gòu)建單細胞RNA測序文庫，使用Illumina測序平臺進行高通量測序，獲取每個細胞的基因表達數(shù)據(jù)。

6、數(shù)據(jù)分析
對單細胞RNA測序數(shù)據(jù)進行預處理，包括過濾低質(zhì)量細胞和去除背景噪音。使用聚類分析和標記基因表達水平，鑒定類器官中的不同細胞類型。應(yīng)用偽時間分析（pseudotime analysis）構(gòu)建細胞發(fā)育軌跡，研究不同基因敲除對細胞分化路徑的影響。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)組數(shù)據(jù)，構(gòu)建類器官的發(fā)育基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，識別ASD相關(guān)基因的調(diào)控模塊。

7、實驗驗證
在特異性誘導多能干細胞（iPSCs）生成的患病類器官中，驗證關(guān)鍵基因（如ARID1B）對細胞命運決定的影響，與未進行基因編輯的類器官進行對照，分析基因敲除的具體效應(yīng)。

03 實驗結(jié)果

Figure 1

展示了用于人腦類器官中ASD風險基因篩選的CHOOSE系統(tǒng)。使用了帶有條形碼的雙sgRNA，在多個時間點評估了gRNA的編輯效率和分布。通過UMAP展示了scRNA-seq數(shù)據(jù)集中的背側(cè)和腹側(cè)大腦區(qū)域軌跡。熱圖展示了不同細胞類型中標志基因的表達，RNA速率分析顯示了發(fā)育方向 。
 

Figure 2

顯示了24個基因干擾下細胞類型豐度的顯著變化。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因干擾導致背側(cè)-腹側(cè)細胞比例的降低。具體基因如KMT2C的干擾導致背側(cè)細胞的減少和腹側(cè)細胞的增加。某些基因干擾只影響特定細胞類型，例如ADNP、MED13L、ILF2和DDX3X 。

Figure 3

比較了不同基因干擾條件下的基因表達變化。圖中展示了DEGs（差異表達基因）在不同TF模塊中的富集情況，如MEF2C、BCL11A、SATB2和OLIG1。這些富集的TF模塊與ASD的相關(guān)基因有顯著的關(guān)聯(lián) 。

Figure 4

描述了一位ARID1B突變患者的腦發(fā)育情況。使用SNP分型顯示在6號染色體上的一個微缺失�；颊咴趦蓚�妊娠階段的GE（LGE和CGE）體積與年齡匹配的對照組的比較。數(shù)據(jù)表明，ARID1B突變可能導致GE體積的異常增大 。這些圖展示了ASD相關(guān)基因在腦類器官中的影響，揭示了基因干擾如何導致特定細胞類型的變化以及這些變化與ASD癥狀的潛在關(guān)聯(lián)。

04 總結(jié)

這項研究開發(fā)了一種高效的CHOOSE系統(tǒng)，實現(xiàn)了在類器官中進行大規(guī)�；�因功能研究的可能性。研究結(jié)果表明，ASD高風險基因?qū)Υ竽X類器官的發(fā)育有顯著影響，特別是在細胞命運決定和發(fā)育階段的調(diào)控上。干擾BAF復合物的成員（如ARID1B）會導致腹側(cè)端腦祖細胞數(shù)量增加，且ARID1B控制祖細胞向少突膠質(zhì)前體細胞和中間神經(jīng)元的轉(zhuǎn)變。這一發(fā)現(xiàn)通過患者特異性iPSC衍生的類器官得到了驗證。這項研究為在人類類器官模型中表征疾病易感基因的表型奠定了基礎(chǔ)。

本文創(chuàng)新性地結(jié)合了CRISPR基因編輯和單細胞轉(zhuǎn)錄組學技術(shù)，建立了一個強大的篩選系統(tǒng)，揭示了ASD相關(guān)基因在大腦發(fā)育中的重要作用。研究結(jié)果不僅拓展了我們對自閉癥發(fā)病機制的理解，還為未來利用類器官模型進行疾病研究和藥物篩選提供了新方法。