原核蛋白表達中宿主菌和表達載體的選擇方法及考慮因素

在生命科學的探索之路上，原核蛋白表達重要的技術(shù)手段。然而，在這個過程中，科研人員常常面臨諸多難點。比如，蛋白表達量低得讓人沮喪，好不容易進行實驗，卻發(fā)現(xiàn)經(jīng)過漫長的等待后只得到微量的產(chǎn)物；或者蛋白錯誤折疊，形成難以處理的包涵體，使得后續(xù)的純化和研究工作舉步維艱；又或者在選擇宿主菌和表達載體時感到迷茫，如同在迷霧中摸索，不知哪一個組合才是最佳選擇。那么，如何破解這些難題呢？關鍵就在于正確選擇原核蛋白表達的宿主菌和表達載體。你選對了嗎？讓我們一同深入探討，尋找成功開啟原核蛋白表達之門的鑰匙。

原核表達常用宿主菌

1. 大腸桿菌（Escherichia coli）：

優(yōu)點：

生長快速且培養(yǎng)簡單：大腸桿菌是一種生長速度極快的細菌，在適宜的條件下，如使用 LB 培養(yǎng)基，在 37℃下培養(yǎng)，其細胞數(shù)量可以在短時間內(nèi)快速增加，一般幾個小時就能達到較高的密度，這有利于快速獲得大量的表達蛋白。而且對培養(yǎng)環(huán)境和營養(yǎng)條件的要求不高，培養(yǎng)成本低廉。

遺傳背景清楚：作為一種被廣泛研究的模式生物，大腸桿菌的基因組信息已經(jīng)被深入研究和了解，其遺傳操作方法成熟，便于進行基因工程改造和蛋白表達的調(diào)控。

表達水平高：具有較強的蛋白表達能力，能夠高效地表達外源基因，適用于小到中等大小的蛋白表達，對于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白具有重要意義。

可選擇的表達載體和菌株豐富：有多種不同的表達載體可供選擇，如 pET 系列、pGEX 系列等，這些載體具有不同的啟動子、標簽和篩選標記等，可以根據(jù)實驗需求進行選擇。同時，也有多種大腸桿菌菌株經(jīng)過改造和優(yōu)化，適用于不同的表達需求，如 BL21 (DE3)、JM109、W3110、Origami、Rosetta 等。

缺點：

缺乏真核細胞的翻譯后修飾能力：原核生物的翻譯后修飾系統(tǒng)與真核生物有很大的差異，大腸桿菌無法進行如糖基化、磷酸化、乙�；�等復雜的翻譯后修飾，這可能會影響某些蛋白的活性和功能。

易形成包涵體：在表達一些蛋白時，由于蛋白的折疊和組裝過程受到影響，容易形成不溶性的包涵體，這不僅會降低蛋白的表達量，還需要額外的步驟進行包涵體的變性和復性，增加了實驗的復雜性和難度。

產(chǎn)生內(nèi)毒素：大腸桿菌會產(chǎn)生內(nèi)毒素（脂多糖），內(nèi)毒素的存在可能會影響蛋白的純度和質(zhì)量，并且在一些應用中，如藥物研發(fā)和生產(chǎn)，內(nèi)毒素的去除是一個必要的步驟，這增加了下游處理的成本和難度。

2. 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：

優(yōu)點：

分泌表達能力強：具有較強的分泌表達能力，能夠?qū)⒈磉_的蛋白分泌到細胞外，這有利于蛋白的分離和純化，減少了細胞破碎等操作步驟，提高了蛋白的純度和產(chǎn)量。

不產(chǎn)生內(nèi)毒素：與大腸桿菌不同，枯草芽孢桿菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，因此在生物安全性方面具有一定的優(yōu)勢，特別適用于對生物安全性要求較高的蛋白質(zhì)表達。

蛋白折疊正確：細胞內(nèi)的環(huán)境有利于蛋白的正確折疊，能夠表達出具有正確構(gòu)象和活性的蛋白，對于一些需要正確折疊才能發(fā)揮功能的蛋白，枯草芽孢桿菌是一個較好的選擇。

具有一定的抗逆性：能夠在較為惡劣的環(huán)境條件下生長，如高溫、高鹽等，這使得在一些特殊的培養(yǎng)條件下進行蛋白表達成為可能。

缺點：

表達效率相對較低：與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌的蛋白表達效率相對較低，需要較長的時間才能獲得足夠量的蛋白，這可能會增加實驗的周期和成本。

遺傳操作相對復雜：雖然枯草芽孢桿菌的遺傳操作技術(shù)也在不斷發(fā)展，但相對于大腸桿菌來說，其遺傳操作仍然較為復雜，需要較高的技術(shù)水平和經(jīng)驗。

可能存在蛋白酶降解：枯草芽孢桿菌細胞內(nèi)存在一些蛋白酶，可能會對表達的蛋白進行降解，從而影響蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量，需要采取一些措施來抑制蛋白酶的活性。

3. 乳酸菌（Lactococcus lactis）：

優(yōu)點：

安全性高：乳酸菌是一種常見的益生菌，對人體和動物無害，因此在食品和醫(yī)藥領域的應用具有較高的安全性。

適合表達分泌型蛋白：具有良好的分泌表達系統(tǒng)，能夠?qū)⒈磉_的蛋白分泌到細胞外，便于蛋白的提取和純化，并且分泌的蛋白通常具有較好的穩(wěn)定性。

可進行食品級表達：在食品工業(yè)中，乳酸菌可以作為一種食品級的表達宿主，用于生產(chǎn)食品添加劑、酶制劑等，不需要進行復雜的下游處理和去除內(nèi)毒素等步驟。

缺點：

表達水平有限：乳酸菌的蛋白表達水平相對較低，對于需要大量生產(chǎn)蛋白的實驗可能不太適用。

培養(yǎng)條件苛刻：乳酸菌對培養(yǎng)條件有一定的要求，如需要特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度等，這增加了實驗的操作難度和成本。

4. 沙門氏菌（Salmonella）：

優(yōu)點：

免疫原性強：作為一種病原菌，沙門氏菌具有較強的免疫原性，表達的蛋白可以作為疫苗的候選抗原，用于疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)。

能夠表達一些在真核環(huán)境中難以表達的蛋白：對于一些在真核細胞中難以表達的蛋白，沙門氏菌可能具有一定的優(yōu)勢，能夠?qū)崿F(xiàn)這些蛋白的表達。

缺點：

安全性問題：沙門氏菌是一種病原菌，在操作過程中需要嚴格的安全防護措施，以防止細菌的泄漏和感染，這增加了實驗的風險和難度。

表達系統(tǒng)復雜：沙門氏菌的表達系統(tǒng)相對較為復雜，需要對細菌的生長和表達條件進行精確的控制，否則可能會影響蛋白的表達效率和質(zhì)量。

5. 藍細菌（Cyanobacteria）：

優(yōu)點：

光合作用能力：藍細菌具有光合作用能力，能夠利用光能進行生長和代謝，因此在培養(yǎng)過程中不需要添加有機碳源，降低了培養(yǎng)成本，并且對環(huán)境友好。

易于基因操作：隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，藍細菌的基因操作技術(shù)也逐漸成熟，能夠方便地進行外源基因的導入和表達調(diào)控。

可大規(guī)模培養(yǎng)：可以在光生物反應器中進行大規(guī)模培養(yǎng)，具有較高的生產(chǎn)潛力，適用于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白。

缺點：

生長速度較慢：與大腸桿菌等細菌相比，藍細菌的生長速度較慢，這可能會影響蛋白的生產(chǎn)效率。

蛋白表達量不穩(wěn)定：藍細菌的蛋白表達量受到多種因素的影響，如光照強度、溫度、營養(yǎng)條件等，因此蛋白表達量的穩(wěn)定性較差，需要對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化和控制。

宿主菌選擇的考慮因素

1. 蛋白表達量：

如果需要大量表達目標蛋白，例如用于大規(guī)模生產(chǎn)或需要高產(chǎn)量的實驗，可選擇具有高拷貝數(shù)質(zhì)粒且蛋白表達能力強的菌株，如大腸桿菌 BL21 (DE3) 系列。這些菌株經(jīng)過改造，能夠高效表達外源基因，適合對表達量要求較高的情況。

對于一些對表達量要求不高，但需要精確控制表達水平的實驗，例如研究蛋白的功能或進行結(jié)構(gòu)分析，可能需要選擇表達水平相對較低但可調(diào)控性較強的菌株，如帶有嚴謹調(diào)控系統(tǒng)的菌株。

2. 蛋白的特性：

蛋白大小：對于小到中等大小的蛋白，大多數(shù)原核宿主菌都能較好地表達。但如果是較大的蛋白（如分子量超過 100 kDa），可能需要選擇具有特殊機制來幫助蛋白正確折疊和組裝的宿主菌，比如一些能夠增強分子伴侶表達的菌株，以提高大蛋白的表達效率和正確折疊。

是否含特殊結(jié)構(gòu)或修飾：如果目標蛋白需要形成二硫鍵以獲得正確的折疊和活性，那么應選擇有利于二硫鍵形成的菌株，如 K-12 衍生菌 Origami2 系列等。這些菌株的細胞質(zhì)是相對氧化的環(huán)境，可以促進二硫鍵的形成，能夠提高蛋白的可溶性及活性。如果蛋白需要進行糖基化等特殊修飾，原核宿主菌一般不能滿足需求，需要選擇真核表達系統(tǒng)，但在一些研究中，如果只是需要初步驗證蛋白的功能，原核表達系統(tǒng)也可以作為一種選擇，不過要注意蛋白的修飾情況可能與天然狀態(tài)不同。

3. 宿主菌的遺傳特性：

密碼子偏好性：真核細胞和原核細胞的密碼子偏好性有所不同，當用原核系統(tǒng)表達真核基因時，真核基因中的一些密碼子對于原核細胞來說可能是稀有密碼子，從而導致表達效率和表達水平很低。此時，可以選擇攜帶稀有密碼子對應 tRNA 的宿主菌，如 Rosetta 系列菌株，能夠補充大腸桿菌缺乏的稀有密碼子對應的 tRNA，提高外源基因尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平。

蛋白酶特性：有些宿主菌內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會降解外源表達產(chǎn)物，導致蛋白不穩(wěn)定。因此，對于容易被蛋白酶降解的蛋白，應選擇蛋白酶缺陷型菌株作為宿主菌，如 BL21 系列就是 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷型，是比較理想的起始表達菌株。

基因的兼容性：要確保宿主菌的基因組與外源基因的兼容性，避免出現(xiàn)基因沉默、不兼容等問題。例如，某些宿主菌可能對特定的 DNA 序列或基因結(jié)構(gòu)存在排斥或不識別的情況，在選擇宿主菌時需要考慮這一點。

4. 安全性和生物相容性：

內(nèi)毒素的產(chǎn)生：如果表達的蛋白用于醫(yī)療或生物制品等對安全性要求較高的領域，需要考慮宿主菌產(chǎn)生內(nèi)毒素的情況。大腸桿菌通常會產(chǎn)生內(nèi)毒素，而一些其他的原核宿主菌，如乳酸桿菌，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，對于生物安全性要求較高的蛋白質(zhì)表達適用。

宿主菌的致病性：某些原核宿主菌具有致病性，在實驗操作和后續(xù)應用中可能存在安全風險，需要謹慎選擇。例如，傷寒沙門氏菌雖然可以用于蛋白表達，但處理要求更為復雜，相對較少被使用。

5. 培養(yǎng)條件和生長特性：

培養(yǎng)成本和難度：一些宿主菌的培養(yǎng)條件較為簡單，生長速度快，培養(yǎng)成本低，如大腸桿菌，易于在實驗室中進行大規(guī)模培養(yǎng)和操作；而有些菌株可能需要特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，增加了實驗的成本和難度。在選擇宿主菌時，需要考慮實驗室的培養(yǎng)條件和成本預算。

生長速度：對于需要快速獲得蛋白的實驗，選擇生長速度快的宿主菌可以縮短實驗周期。一般來說，大腸桿菌等常見的原核宿主菌生長速度較快，能夠在較短時間內(nèi)達到較高的細胞密度，有利于蛋白的表達。

6. 與表達載體的兼容性：

抗生素抗性：表達載體通常攜帶抗生素抗性基因，用于篩選轉(zhuǎn)化成功的宿主菌。在選擇宿主菌時，要確保其抗生素抗性與表達載體相匹配，例如，如果表達載體攜帶氨芐青霉素抗性基因，那么宿主菌應具有對氨芐青霉素的敏感性，以便通過添加氨芐青霉素來篩選陽性克隆。同時，也要注意一些宿主菌可能本身已經(jīng)攜帶某種抗生素抗性，避免使用相同的抗生素進行篩選。

啟動子的兼容性：不同的表達載體可能使用不同的啟動子，而宿主菌需要具有與啟動子相匹配的轉(zhuǎn)錄機制才能實現(xiàn)基因的有效表達。例如，某些表達載體使用 T7 啟動子，就需要選擇含有 T7 RNA 聚合酶的宿主菌，如 BL21 (DE3) 等。

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