利用染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序技術(shù)ChIP-seq等揭示頭頸鱗癌免疫逃逸機(jī)制
免疫逃逸是癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵里程碑，是腫瘤免疫治療的理論基礎(chǔ)。頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)）是全球最常見的惡性腫瘤之一，傳統(tǒng)治療選擇包括手術(shù)切除、放療和化療。最近，利用免疫檢查點(diǎn)抑制劑如PD-1/PD-L1單克隆抗體的免疫療法，已成為治療難治性復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移HNSCC的有希望方法。但超過(guò)80%患者仍然表現(xiàn)出固有的藥物抗性，不能單獨(dú)從PD-1/PD-L1免疫療法中受益。其他免疫檢查點(diǎn)分子在HNSCC免疫逃逸中的潛力，影響抗PD-1/PD-L1免疫療法的效果。因此，進(jìn)一步探索HNSCC免疫逃逸機(jī)制具有至關(guān)重要的意義。
人類乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV）感染與多種HNSCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)，HPV16、18、31、33和35等高風(fēng)險(xiǎn)類型，易于誘發(fā)各種人類惡性腫瘤，其中HPV16是最普遍的高風(fēng)險(xiǎn)亞型。最近發(fā)現(xiàn)HPV可以編碼環(huán)狀RNA（circRNA），而circE7是唯一被鑒定出由高風(fēng)險(xiǎn)HPV16特異性編碼的環(huán)狀RNA。circE7通過(guò)影響宿主細(xì)胞的表觀遺傳調(diào)控，可能參與腫瘤免疫逃逸和免疫治療抗性形成。但circE7的生物學(xué)功能仍然大部分未知，它在腫瘤免疫逃逸和免疫療法抗性中的參與尚未被報(bào)道。
2024年10月4日，中南大學(xué)博士后葛軍尚、博士生孟依、碩士生郭佳玥為并列第一作者，中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院曾朝陽(yáng)、熊煒和中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心龔朝建為共同通訊作者，利用染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序技術(shù)（ChIP-seq）等實(shí)驗(yàn)揭示了HPV編碼的環(huán)狀RNA circE7促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的免疫逃逸機(jī)制。相關(guān)研究成果以“Human papillomavirus-encoded circular RNA circE7 promotes immune evasion in head and neck squamous cell carcinoma”為題發(fā)表在Nature子刊《nature communications》上。
標(biāo)題：Human papillomavirus-encoded circular RNA circE7 promotes immune evasion in head and neck squamous cell carcinoma（HPV編碼的環(huán)狀RNA circE7促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的免疫逃逸）
期刊：Nature Communications
影響因子： IF 14.7 / 1區(qū)
技術(shù)平臺(tái)：RT-qPCR、RNA pulldown、western blot、ChIP-seq、RIP實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等
本研究通過(guò)整合23對(duì)HNSCC腫瘤樣本及其鄰近正常組織，以及105個(gè)HNSCC患者的石蠟包埋樣本，結(jié)合細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，首先觀察到circE7表達(dá)與HPV HNSCC臨床組織中浸潤(rùn)的T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，circE7通過(guò)表觀遺傳機(jī)制下調(diào)LGALS9基因（編碼Galectin-9蛋白），從而抑制T細(xì)胞功能和活性，進(jìn)而促進(jìn)HNSCC免疫逃逸。而LGALS9基因編碼的galectin-9蛋白能夠與T細(xì)胞表面的TIM-3和PD-1等免疫檢查點(diǎn)分子結(jié)合，進(jìn)而激活T細(xì)胞釋放細(xì)胞毒性細(xì)胞因子并抑制T細(xì)胞凋亡。circE7下調(diào)Galectin-9，導(dǎo)致CD8+T功能和活性受到抑制；而circE7下調(diào)LGALS9表達(dá)的具體分子機(jī)制是circE7結(jié)合并抑制乙酰輔酶A羧化酶1 (acetyl-CoA carboxylase 1, ACC1)的磷酸化和激活，降低細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A水平，導(dǎo)致LGALS9啟動(dòng)子區(qū)域H3K27乙酰化水平降低，通過(guò)表觀遺傳調(diào)控抑制LGALS9的表達(dá)；最后通過(guò)體內(nèi)外模型證實(shí)聯(lián)合使用TIM-3 (Galectin-9在T細(xì)胞上的受體)與PD-1單克隆抗體能顯著提高HNSCC的免疫治療效果。②
總之，本研究展示了HPV通過(guò)circE7驅(qū)動(dòng)的表觀遺傳修飾促進(jìn)HNSCC免疫逃逸機(jī)制，并提出了聯(lián)合使用抗PD-1和抗TIM-3抑制劑的HNSCC潛在免疫治療策略，這種聯(lián)合治療選擇可以增強(qiáng)HNSCC免疫療法的效果，為頭頸鱗癌免疫治療提供了新靶點(diǎn)和潛在治療策略。
結(jié)果圖形
（1）circE7在HPV+（陽(yáng)性）的HNSCC中表達(dá)，并與T細(xì)胞浸潤(rùn)和galectin-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
圖1：circE7在HPV+ HNSCC中高表達(dá)，且與CD8+ T細(xì)胞功能和免疫檢查點(diǎn)galectin-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。A. 通過(guò)設(shè)計(jì)跨剪接位點(diǎn)引物并使用Sanger測(cè)序，鑒定circE7為通過(guò)HPV16 E6尾部、E7和部分E1序列的反向剪接形成的472nt環(huán)狀RNA。
B. 使用23個(gè)HNSCC組織進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)CD8A、IFNG、GZMB和TNFA的表達(dá)，并分析了它們與circE7表達(dá)的相關(guān)性。與circE7陰性樣本相比，circE7陽(yáng)性HNSCC樣本中CD8A、IFNG、GZMB和TNFA的表達(dá)顯著降低。（circE7陰性，n=16；circE7陽(yáng)性，n=7）。
C. 在105個(gè)HNSCC組織中，通過(guò)原位雜交檢測(cè)circE7表達(dá)。通過(guò)免疫組化檢測(cè)浸潤(rùn)C(jī)D8+ T細(xì)胞中p16、HPV16 E7蛋白和CD8A的表達(dá)。在這105個(gè)HNSCC病例中，有17個(gè)是HPV陽(yáng)性，所有這些病例都是HPV16陽(yáng)性且circE7表達(dá)。circE7表達(dá)水平與CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)。（HPV陰性，n=88；HPV陽(yáng)性，n=17）。
D-F. 在HPV陰性HNSCC細(xì)胞系CAL27和HN30中過(guò)表達(dá)circE7，或在HPV16陽(yáng)性HNSCC細(xì)胞系SCC090和SCC154中轉(zhuǎn)染靶向circE7的siRNA。RT-qPCR（D）檢測(cè)LGALS9 mRNA，western blotting（E）和流式細(xì)胞術(shù)（F）檢測(cè)galectin-9蛋白表達(dá)。
G. 在（B）中使用的23個(gè)新鮮HNSCC組織樣本上進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)LGALS9 mRNA。與circE7陰性組織相比，circE7陽(yáng)性HNSCC組織中LGALS9 mRNA水平顯著降低。（circE7陰性，n=16；circE7陽(yáng)性，n=7）。
H. 通過(guò)免疫組化在（C）中使用的105個(gè)HNSCC組織上檢測(cè)galectin-9表達(dá)，并分析其與circE7表達(dá)的相關(guān)性。（circE7陰性，n=88；circE7陽(yáng)性，n=17）。
（2）circE7通過(guò)下調(diào)LGALS9表達(dá)促進(jìn)HNSCC免疫逃逸
圖2：circE7下調(diào)HNSCC細(xì)胞中g(shù)alectin-9表達(dá)，以體外抑制CD8+ T細(xì)胞功能。
在CAL27、HN30、SCC090和SCC154細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)或敲低LGALS9，隨后與人原代T細(xì)胞以1:10的比例共培養(yǎng)6小時(shí)。
A. 通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)原代T細(xì)胞中IFNG、GZMB和TNFA的表達(dá)水平。在CAL27和HN30細(xì)胞系中，同時(shí)過(guò)表達(dá)circE7和LGALS9。在SCC090和SCC154細(xì)胞系中，同時(shí)敲低circE7和LGALS9。然后將這些細(xì)胞與人原代T細(xì)胞共培養(yǎng)6小時(shí)。
B. T-qPCR用于檢測(cè)IFNG、GZMB和TNFA mRNA表達(dá)。
C. 通過(guò)ELISA檢測(cè)共培養(yǎng)基中IFN-γ、GZMB和TNF-α的水平。
D-E. 流式細(xì)胞術(shù)以鑒定總CD8+ T細(xì)胞中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+ T細(xì)胞的比例。
F. 通過(guò)Annexin V/PI染色后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)以評(píng)估凋亡CD8+ T細(xì)胞比例。
G. 使用Annexin V/PI染色后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)以凋亡腫瘤細(xì)胞比例。
（3）Galectin-9通過(guò)與TIM-3和PD-1結(jié)合增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞的抗腫瘤活性
圖3：Galectin-9通過(guò)與TIM-3和PD-1結(jié)合增強(qiáng)T細(xì)胞的功能和活性。在CAL27、HN30、SCC090和SCC154細(xì)胞中，進(jìn)行Galectin-9過(guò)表達(dá)或敲低，然后加入10mg/mL乳糖，并與人原代T細(xì)胞以1:10比例共培養(yǎng)6小時(shí)。
A. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)總CD8+ T細(xì)胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+細(xì)胞的百分比。
B. 使用Annexin V/PI檢測(cè)評(píng)估CD8+ T細(xì)胞的凋亡水平。在CAL27、HN30、SCC090和SCC154細(xì)胞中，進(jìn)行Galectin-9過(guò)表達(dá)或敲低，然后加入5μg/mL抗PD-1和抗TIM-3，并與人原代T細(xì)胞以1:10的比例共培養(yǎng)6小時(shí)。
C. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)總CD8+ T細(xì)胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+細(xì)胞的百分比。
D. 使用Annexin V/PI檢測(cè)評(píng)估CD8+ T細(xì)胞的凋亡水平。此外，人原代T細(xì)胞與1μg/mL重組Galectin-9蛋白共培養(yǎng)，同時(shí)加入抗TIM-3、抗PD-1和乳糖。
E. 使用Annexin V/PI檢測(cè)評(píng)估CD8+ T細(xì)胞的凋亡水平。
F. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)總CD8+ T細(xì)胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+細(xì)胞的百分比。人原代CD8+ T細(xì)胞與1μg/mL重組Galectin-9、HMGB1蛋白和抗TIM-3共培養(yǎng)。
G. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)總CD8+ T細(xì)胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+細(xì)胞的百分比。BSA為陰性對(duì)照。
H. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)附著在CD8+ T細(xì)胞表面的Galectin-9和HMGB1蛋白水平。
（4）circE7結(jié)合并激活A(yù)CC1以抑制乙酰輔酶A（acetyl-CoA）并抑制Galectin-9表達(dá)
圖4：circE7表觀遺傳下調(diào)ACC1介導(dǎo)的Galectin-9表達(dá)。
A. 使用生物素標(biāo)記的circE7探針進(jìn)行RNA pulldown分析，以檢測(cè)CAL27和HN30細(xì)胞中circE7與ACC1蛋白之間的結(jié)合。非生物素標(biāo)記的circE7探針用作對(duì)照。
B. 在circE7過(guò)表達(dá)的CAL27和HN30細(xì)胞、或HPV陽(yáng)性SCC090和SCC154細(xì)胞中，使用抗ACC1抗體進(jìn)行RIP檢測(cè)ACC1蛋白與circE7的結(jié)合，然后RT-qPCR定量分析。
C. 使用抗Flag抗體進(jìn)行RNA免疫沉淀，以評(píng)估ACC1蛋白與其截?cái)嗤蛔凅w與circE7的結(jié)合，然后對(duì)circE7進(jìn)行RT-qPCR分析。
D. 使用生物素標(biāo)記的circE7探針進(jìn)行RNA pulldown，并使用抗Flag抗體進(jìn)行western blot，以檢測(cè)circE7與ACC1及其截?cái)嗤蛔凅w之間的結(jié)合。
E. 使用抗ACC1抗體進(jìn)行RNA免疫沉淀，以評(píng)估ACC1蛋白與circE7及其截?cái)嗤蛔凅w之間的直接結(jié)合，然后對(duì)circE7及其截?cái)嗤蛔凅w進(jìn)行RT-qPCR分析。
F. 使用生物素標(biāo)記的circE7探針進(jìn)行RNA pulldown，以研究circE7及其截?cái)嗤蛔凅w與ACC1蛋白之間的結(jié)合。在CAL27和HN30細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circE7，或在SCC090和SCC154細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-circE7。
G. western blot檢測(cè)總ACC1蛋白和p-ACC1蛋白的表達(dá)水平。
H. 使用乙酰輔酶A檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞裂解物中的乙酰輔酶A含量。
I. western blot檢測(cè)整體乙�；谋磉_(dá)水平。
J. western blot 檢測(cè)H3K27 Ac、H3K9 Ac、H3K14 Ac和H3K23 Ac的表達(dá)水平。
K. 在HN30細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circE7，ChIP-seq peaks顯示LGALS9啟動(dòng)子區(qū)域的H3K27ac水平。橫軸代表基因組坐標(biāo)，縱軸代表ChIP-seq信號(hào)強(qiáng)度。
L. ChIP-qPCR用于研究在CAL27和HN30細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circE7或在SCC090和SCC154細(xì)胞中敲低circE7后LGALS9啟動(dòng)子區(qū)域H3K27乙酰化水平變化。
圖4-1：HN30細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circE7的ChIP-seq和ChIP-qPCR分析。
M. 在HN30細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circE7，CHIP-seq peaks顯示H3K27ac的整體水平。
N. hockey stick plot顯示在HN30細(xì)胞中，與Vector和OE-circE7相比，突出顯示SE相關(guān)基因的input歸一化、等級(jí)排序的H3K27ac信號(hào)。
O. 在GSE1855312和ENCODE數(shù)據(jù)庫(kù)中分析LGALS9啟動(dòng)子區(qū)域的H3K27Ac水平。
圖5：ACC1是circE7在LGALS9轉(zhuǎn)錄表觀遺傳調(diào)控中的關(guān)鍵下游調(diào)控靶點(diǎn)。
A. 三個(gè)ACC1 siRNA被轉(zhuǎn)染到CAL27和HN30細(xì)胞中，或在SCC090和SCC154細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ACC1，使用RT-qPCR檢測(cè)LGALS9 mRNA表達(dá)水平。
B. 使用Western blot檢測(cè)ACC1和galectin-9蛋白的表達(dá)水平。在CAL27和HN30細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circE7的同時(shí)敲低ACC1，或者在SCC090和SCC154細(xì)胞中敲低circE7的同時(shí)過(guò)表達(dá)ACC1。
C. 使用RT-qPCR檢測(cè)LGALS9 mRNA的表達(dá)水平。
D. 使用Western blot檢測(cè)ACC1、H3K27 Ac和galectin-9蛋白的水平。在CAL27和HN30細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circE7的同時(shí)加入ACC1的小分子抑制劑TOFA。
E. 使用RT-qPCR檢測(cè)LGALS9 mRNA的表達(dá)水平。
F. 使用Western blot檢測(cè)H3K27Ac和galectin-9蛋白水平。
（5）TIM-3和PD-1單克隆抗體的聯(lián)合應(yīng)用大大提高了HNSCC免疫治療效果
圖6：外源性TIM-3和PD-1單克隆抗體的聯(lián)合治療增強(qiáng)了CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能。
CAL27和HN30細(xì)胞進(jìn)行circE7過(guò)表達(dá)，或SCC090和SCC154細(xì)胞circE7敲低，然后與人原代T細(xì)胞共培養(yǎng)6小時(shí)，加入5μg/mL抗PD-1或抗PD-1/TIM-3。
A. 使用RT-qPCR檢測(cè)CD8+ T細(xì)胞中IFNG、GZMB和TNFA mRNA的表達(dá)水平。
B. 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所有CD8+ T細(xì)胞中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+ T細(xì)胞的比例。
C-D. 使用Annexin V/PI染色評(píng)估CD8+ T細(xì)胞（C）和腫瘤細(xì)胞（D）的凋亡水平。
圖7：TIM-3和PD-1單克隆抗體的聯(lián)合治療顯著提高了HNSCC免疫治療效果。
裸鼠通過(guò)右后肢注射1×10^6過(guò)表達(dá)circE7的HN30細(xì)胞或載體對(duì)照，或注射敲低circE7或NC對(duì)照的SCC090細(xì)胞來(lái)形成異種移植腫瘤。7天和14天后，注射人原代T細(xì)胞和20μg/每個(gè)的抗PD-1或抗PD-1/TIM-3進(jìn)行免疫治療。
A-B. T細(xì)胞被標(biāo)記為DeepRed，進(jìn)行體內(nèi)成像以檢測(cè)攜帶腫瘤小鼠中人原代T細(xì)胞的生存和分布（每組n=3）。A 代表性圖像；B 注射后1、3、5和7天收集的腫瘤部位（右大腿底部）的DiR熒光信號(hào)與T細(xì)胞熒光強(qiáng)度比率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。顏色標(biāo)尺代表小鼠T細(xì)胞的DiR熒光強(qiáng)度。
C. 代表性腫瘤圖像。左圖，HN30細(xì)胞注射后24天（每組n=6）；右圖，SCC090細(xì)胞注射后56天（每組n=6）。
D. 每周實(shí)時(shí)測(cè)量注射HN30或SCC090細(xì)胞的小鼠的腫瘤體積（每組n=6）。
E. 通過(guò)免疫組化檢測(cè)石蠟包埋的HN30和SCC090異種移植腫瘤中Galectin-9表達(dá)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（每組n=6）。
F. 通過(guò)免疫組化檢測(cè)HN30和SCC090異種移植腫瘤中CD8A的表達(dá)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（每組n=6）。
圖8：小鼠原位移植模型顯示PD-1和TIM-3單克隆抗體的聯(lián)合使用增強(qiáng)了HNSCC免疫治療的療效。C3H小鼠在右側(cè)臉頰注射2×10^5過(guò)表達(dá)circE7的SCC-7細(xì)胞或載體對(duì)照，形成異種移植腫瘤。3天后，注射20μg/次的抗PD-1或抗PD-1/TIM-3進(jìn)行免疫治療。
A. 代表性腫瘤圖像（每組n=7）。
B. 腫瘤體積在SCC-7細(xì)胞注射后3天、7天和10天的測(cè)量結(jié)果（每組n=7）。
C. 注射SCC-7細(xì)胞后10天測(cè)量的腫瘤重量（每組n=7）。
D. 從小鼠腫瘤組織中制備單細(xì)胞懸浮液，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)IFNG、GZMB和TNFA mRNA表達(dá)（每組n=3）。
E. 使用ELISA檢測(cè)IFN-γ、GZMB和TNF-α的含量（每組n=3）。
F-G. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+ T細(xì)胞的比例（F）以及總CD8+ T細(xì)胞群中IFN-γ+ TNF-α+細(xì)胞的百分比（G）（每組n=3）。
H. 通過(guò)免疫組化檢測(cè)SCC-7異種移植腫瘤中Cd8A表達(dá)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（每組n=5）。
I. 通過(guò)免疫組化檢測(cè)石蠟包埋的SCC-7異種移植腫瘤中g(shù)alectin-9表達(dá)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（每組n=5）。
參考文獻(xiàn)：
人類乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV）感染與多種HNSCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)，HPV16、18、31、33和35等高風(fēng)險(xiǎn)類型，易于誘發(fā)各種人類惡性腫瘤，其中HPV16是最普遍的高風(fēng)險(xiǎn)亞型。最近發(fā)現(xiàn)HPV可以編碼環(huán)狀RNA（circRNA），而circE7是唯一被鑒定出由高風(fēng)險(xiǎn)HPV16特異性編碼的環(huán)狀RNA。circE7通過(guò)影響宿主細(xì)胞的表觀遺傳調(diào)控，可能參與腫瘤免疫逃逸和免疫治療抗性形成。但circE7的生物學(xué)功能仍然大部分未知，它在腫瘤免疫逃逸和免疫療法抗性中的參與尚未被報(bào)道。
2024年10月4日，中南大學(xué)博士后葛軍尚、博士生孟依、碩士生郭佳玥為并列第一作者，中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院曾朝陽(yáng)、熊煒和中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心龔朝建為共同通訊作者，利用染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序技術(shù)（ChIP-seq）等實(shí)驗(yàn)揭示了HPV編碼的環(huán)狀RNA circE7促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的免疫逃逸機(jī)制。相關(guān)研究成果以“Human papillomavirus-encoded circular RNA circE7 promotes immune evasion in head and neck squamous cell carcinoma”為題發(fā)表在Nature子刊《nature communications》上。
期刊：Nature Communications
影響因子： IF 14.7 / 1區(qū)
技術(shù)平臺(tái)：RT-qPCR、RNA pulldown、western blot、ChIP-seq、RIP實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等
本研究通過(guò)整合23對(duì)HNSCC腫瘤樣本及其鄰近正常組織，以及105個(gè)HNSCC患者的石蠟包埋樣本，結(jié)合細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，首先觀察到circE7表達(dá)與HPV HNSCC臨床組織中浸潤(rùn)的T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，circE7通過(guò)表觀遺傳機(jī)制下調(diào)LGALS9基因（編碼Galectin-9蛋白），從而抑制T細(xì)胞功能和活性，進(jìn)而促進(jìn)HNSCC免疫逃逸。而LGALS9基因編碼的galectin-9蛋白能夠與T細(xì)胞表面的TIM-3和PD-1等免疫檢查點(diǎn)分子結(jié)合，進(jìn)而激活T細(xì)胞釋放細(xì)胞毒性細(xì)胞因子并抑制T細(xì)胞凋亡。circE7下調(diào)Galectin-9，導(dǎo)致CD8+T功能和活性受到抑制；而circE7下調(diào)LGALS9表達(dá)的具體分子機(jī)制是circE7結(jié)合并抑制乙酰輔酶A羧化酶1 (acetyl-CoA carboxylase 1, ACC1)的磷酸化和激活，降低細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A水平，導(dǎo)致LGALS9啟動(dòng)子區(qū)域H3K27乙酰化水平降低，通過(guò)表觀遺傳調(diào)控抑制LGALS9的表達(dá)；最后通過(guò)體內(nèi)外模型證實(shí)聯(lián)合使用TIM-3 (Galectin-9在T細(xì)胞上的受體)與PD-1單克隆抗體能顯著提高HNSCC的免疫治療效果。②
總之，本研究展示了HPV通過(guò)circE7驅(qū)動(dòng)的表觀遺傳修飾促進(jìn)HNSCC免疫逃逸機(jī)制，并提出了聯(lián)合使用抗PD-1和抗TIM-3抑制劑的HNSCC潛在免疫治療策略，這種聯(lián)合治療選擇可以增強(qiáng)HNSCC免疫療法的效果，為頭頸鱗癌免疫治療提供了新靶點(diǎn)和潛在治療策略。
結(jié)果圖形
（1）circE7在HPV+（陽(yáng)性）的HNSCC中表達(dá)，并與T細(xì)胞浸潤(rùn)和galectin-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
B. 使用23個(gè)HNSCC組織進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)CD8A、IFNG、GZMB和TNFA的表達(dá)，并分析了它們與circE7表達(dá)的相關(guān)性。與circE7陰性樣本相比，circE7陽(yáng)性HNSCC樣本中CD8A、IFNG、GZMB和TNFA的表達(dá)顯著降低。（circE7陰性，n=16；circE7陽(yáng)性，n=7）。
C. 在105個(gè)HNSCC組織中，通過(guò)原位雜交檢測(cè)circE7表達(dá)。通過(guò)免疫組化檢測(cè)浸潤(rùn)C(jī)D8+ T細(xì)胞中p16、HPV16 E7蛋白和CD8A的表達(dá)。在這105個(gè)HNSCC病例中，有17個(gè)是HPV陽(yáng)性，所有這些病例都是HPV16陽(yáng)性且circE7表達(dá)。circE7表達(dá)水平與CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)。（HPV陰性，n=88；HPV陽(yáng)性，n=17）。
D-F. 在HPV陰性HNSCC細(xì)胞系CAL27和HN30中過(guò)表達(dá)circE7，或在HPV16陽(yáng)性HNSCC細(xì)胞系SCC090和SCC154中轉(zhuǎn)染靶向circE7的siRNA。RT-qPCR（D）檢測(cè)LGALS9 mRNA，western blotting（E）和流式細(xì)胞術(shù)（F）檢測(cè)galectin-9蛋白表達(dá)。
G. 在（B）中使用的23個(gè)新鮮HNSCC組織樣本上進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)LGALS9 mRNA。與circE7陰性組織相比，circE7陽(yáng)性HNSCC組織中LGALS9 mRNA水平顯著降低。（circE7陰性，n=16；circE7陽(yáng)性，n=7）。
H. 通過(guò)免疫組化在（C）中使用的105個(gè)HNSCC組織上檢測(cè)galectin-9表達(dá)，并分析其與circE7表達(dá)的相關(guān)性。（circE7陰性，n=88；circE7陽(yáng)性，n=17）。
（2）circE7通過(guò)下調(diào)LGALS9表達(dá)促進(jìn)HNSCC免疫逃逸
圖2：circE7下調(diào)HNSCC細(xì)胞中g(shù)alectin-9表達(dá)，以體外抑制CD8+ T細(xì)胞功能。
A. 通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)原代T細(xì)胞中IFNG、GZMB和TNFA的表達(dá)水平。在CAL27和HN30細(xì)胞系中，同時(shí)過(guò)表達(dá)circE7和LGALS9。在SCC090和SCC154細(xì)胞系中，同時(shí)敲低circE7和LGALS9。然后將這些細(xì)胞與人原代T細(xì)胞共培養(yǎng)6小時(shí)。
B. T-qPCR用于檢測(cè)IFNG、GZMB和TNFA mRNA表達(dá)。
C. 通過(guò)ELISA檢測(cè)共培養(yǎng)基中IFN-γ、GZMB和TNF-α的水平。
D-E. 流式細(xì)胞術(shù)以鑒定總CD8+ T細(xì)胞中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+ T細(xì)胞的比例。
F. 通過(guò)Annexin V/PI染色后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)以評(píng)估凋亡CD8+ T細(xì)胞比例。
G. 使用Annexin V/PI染色后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)以凋亡腫瘤細(xì)胞比例。
（3）Galectin-9通過(guò)與TIM-3和PD-1結(jié)合增強(qiáng)CD8+ T細(xì)胞的抗腫瘤活性
圖3：Galectin-9通過(guò)與TIM-3和PD-1結(jié)合增強(qiáng)T細(xì)胞的功能和活性。在CAL27、HN30、SCC090和SCC154細(xì)胞中，進(jìn)行Galectin-9過(guò)表達(dá)或敲低，然后加入10mg/mL乳糖，并與人原代T細(xì)胞以1:10比例共培養(yǎng)6小時(shí)。
B. 使用Annexin V/PI檢測(cè)評(píng)估CD8+ T細(xì)胞的凋亡水平。在CAL27、HN30、SCC090和SCC154細(xì)胞中，進(jìn)行Galectin-9過(guò)表達(dá)或敲低，然后加入5μg/mL抗PD-1和抗TIM-3，并與人原代T細(xì)胞以1:10的比例共培養(yǎng)6小時(shí)。
C. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)總CD8+ T細(xì)胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+細(xì)胞的百分比。
D. 使用Annexin V/PI檢測(cè)評(píng)估CD8+ T細(xì)胞的凋亡水平。此外，人原代T細(xì)胞與1μg/mL重組Galectin-9蛋白共培養(yǎng)，同時(shí)加入抗TIM-3、抗PD-1和乳糖。
E. 使用Annexin V/PI檢測(cè)評(píng)估CD8+ T細(xì)胞的凋亡水平。
F. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)總CD8+ T細(xì)胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+細(xì)胞的百分比。人原代CD8+ T細(xì)胞與1μg/mL重組Galectin-9、HMGB1蛋白和抗TIM-3共培養(yǎng)。
G. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)總CD8+ T細(xì)胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+細(xì)胞的百分比。BSA為陰性對(duì)照。
H. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)附著在CD8+ T細(xì)胞表面的Galectin-9和HMGB1蛋白水平。
（4）circE7結(jié)合并激活A(yù)CC1以抑制乙酰輔酶A（acetyl-CoA）并抑制Galectin-9表達(dá)
圖4：circE7表觀遺傳下調(diào)ACC1介導(dǎo)的Galectin-9表達(dá)。
B. 在circE7過(guò)表達(dá)的CAL27和HN30細(xì)胞、或HPV陽(yáng)性SCC090和SCC154細(xì)胞中，使用抗ACC1抗體進(jìn)行RIP檢測(cè)ACC1蛋白與circE7的結(jié)合，然后RT-qPCR定量分析。
C. 使用抗Flag抗體進(jìn)行RNA免疫沉淀，以評(píng)估ACC1蛋白與其截?cái)嗤蛔凅w與circE7的結(jié)合，然后對(duì)circE7進(jìn)行RT-qPCR分析。
D. 使用生物素標(biāo)記的circE7探針進(jìn)行RNA pulldown，并使用抗Flag抗體進(jìn)行western blot，以檢測(cè)circE7與ACC1及其截?cái)嗤蛔凅w之間的結(jié)合。
E. 使用抗ACC1抗體進(jìn)行RNA免疫沉淀，以評(píng)估ACC1蛋白與circE7及其截?cái)嗤蛔凅w之間的直接結(jié)合，然后對(duì)circE7及其截?cái)嗤蛔凅w進(jìn)行RT-qPCR分析。
F. 使用生物素標(biāo)記的circE7探針進(jìn)行RNA pulldown，以研究circE7及其截?cái)嗤蛔凅w與ACC1蛋白之間的結(jié)合。在CAL27和HN30細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circE7，或在SCC090和SCC154細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-circE7。
G. western blot檢測(cè)總ACC1蛋白和p-ACC1蛋白的表達(dá)水平。
H. 使用乙酰輔酶A檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞裂解物中的乙酰輔酶A含量。
I. western blot檢測(cè)整體乙�；谋磉_(dá)水平。
J. western blot 檢測(cè)H3K27 Ac、H3K9 Ac、H3K14 Ac和H3K23 Ac的表達(dá)水平。
K. 在HN30細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circE7，ChIP-seq peaks顯示LGALS9啟動(dòng)子區(qū)域的H3K27ac水平。橫軸代表基因組坐標(biāo)，縱軸代表ChIP-seq信號(hào)強(qiáng)度。
L. ChIP-qPCR用于研究在CAL27和HN30細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circE7或在SCC090和SCC154細(xì)胞中敲低circE7后LGALS9啟動(dòng)子區(qū)域H3K27乙酰化水平變化。
圖4-1：HN30細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circE7的ChIP-seq和ChIP-qPCR分析。
N. hockey stick plot顯示在HN30細(xì)胞中，與Vector和OE-circE7相比，突出顯示SE相關(guān)基因的input歸一化、等級(jí)排序的H3K27ac信號(hào)。
O. 在GSE1855312和ENCODE數(shù)據(jù)庫(kù)中分析LGALS9啟動(dòng)子區(qū)域的H3K27Ac水平。
圖5：ACC1是circE7在LGALS9轉(zhuǎn)錄表觀遺傳調(diào)控中的關(guān)鍵下游調(diào)控靶點(diǎn)。
B. 使用Western blot檢測(cè)ACC1和galectin-9蛋白的表達(dá)水平。在CAL27和HN30細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circE7的同時(shí)敲低ACC1，或者在SCC090和SCC154細(xì)胞中敲低circE7的同時(shí)過(guò)表達(dá)ACC1。
C. 使用RT-qPCR檢測(cè)LGALS9 mRNA的表達(dá)水平。
D. 使用Western blot檢測(cè)ACC1、H3K27 Ac和galectin-9蛋白的水平。在CAL27和HN30細(xì)胞中過(guò)表達(dá)circE7的同時(shí)加入ACC1的小分子抑制劑TOFA。
E. 使用RT-qPCR檢測(cè)LGALS9 mRNA的表達(dá)水平。
F. 使用Western blot檢測(cè)H3K27Ac和galectin-9蛋白水平。
（5）TIM-3和PD-1單克隆抗體的聯(lián)合應(yīng)用大大提高了HNSCC免疫治療效果
圖6：外源性TIM-3和PD-1單克隆抗體的聯(lián)合治療增強(qiáng)了CD8+ T細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能。
A. 使用RT-qPCR檢測(cè)CD8+ T細(xì)胞中IFNG、GZMB和TNFA mRNA的表達(dá)水平。
B. 使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所有CD8+ T細(xì)胞中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+ T細(xì)胞的比例。
C-D. 使用Annexin V/PI染色評(píng)估CD8+ T細(xì)胞（C）和腫瘤細(xì)胞（D）的凋亡水平。
圖7：TIM-3和PD-1單克隆抗體的聯(lián)合治療顯著提高了HNSCC免疫治療效果。
A-B. T細(xì)胞被標(biāo)記為DeepRed，進(jìn)行體內(nèi)成像以檢測(cè)攜帶腫瘤小鼠中人原代T細(xì)胞的生存和分布（每組n=3）。A 代表性圖像；B 注射后1、3、5和7天收集的腫瘤部位（右大腿底部）的DiR熒光信號(hào)與T細(xì)胞熒光強(qiáng)度比率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。顏色標(biāo)尺代表小鼠T細(xì)胞的DiR熒光強(qiáng)度。
C. 代表性腫瘤圖像。左圖，HN30細(xì)胞注射后24天（每組n=6）；右圖，SCC090細(xì)胞注射后56天（每組n=6）。
D. 每周實(shí)時(shí)測(cè)量注射HN30或SCC090細(xì)胞的小鼠的腫瘤體積（每組n=6）。
E. 通過(guò)免疫組化檢測(cè)石蠟包埋的HN30和SCC090異種移植腫瘤中Galectin-9表達(dá)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（每組n=6）。
F. 通過(guò)免疫組化檢測(cè)HN30和SCC090異種移植腫瘤中CD8A的表達(dá)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（每組n=6）。
A. 代表性腫瘤圖像（每組n=7）。
B. 腫瘤體積在SCC-7細(xì)胞注射后3天、7天和10天的測(cè)量結(jié)果（每組n=7）。
C. 注射SCC-7細(xì)胞后10天測(cè)量的腫瘤重量（每組n=7）。
D. 從小鼠腫瘤組織中制備單細(xì)胞懸浮液，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)IFNG、GZMB和TNFA mRNA表達(dá)（每組n=3）。
E. 使用ELISA檢測(cè)IFN-γ、GZMB和TNF-α的含量（每組n=3）。
F-G. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+ T細(xì)胞的比例（F）以及總CD8+ T細(xì)胞群中IFN-γ+ TNF-α+細(xì)胞的百分比（G）（每組n=3）。
H. 通過(guò)免疫組化檢測(cè)SCC-7異種移植腫瘤中Cd8A表達(dá)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（每組n=5）。
I. 通過(guò)免疫組化檢測(cè)石蠟包埋的SCC-7異種移植腫瘤中g(shù)alectin-9表達(dá)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（每組n=5）。
參考文獻(xiàn)：
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- 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院官網(wǎng)：湘雅二醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心龔朝建團(tuán)隊(duì)揭示頭頸鱗癌發(fā)病新機(jī)制 https://www.xyeyy.com/2/17/content_80964.html
標(biāo)簽：
ChIP-seq
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- 文獻(xiàn)解讀：表觀基因組-微生物組軸揭示腸道菌群的宿主調(diào)控
- RNA-BS揭示動(dòng)物不同發(fā)育階段的mRNA m5C甲基化圖譜和調(diào)控機(jī)制
- 單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析揭示與胰腺癌預(yù)后不良相關(guān)的中間態(tài)癌細(xì)胞群
- 空間轉(zhuǎn)錄組系列十月高分文獻(xiàn)速遞
- 卵巢發(fā)育和衰老的m6A 甲基化揭示RNA穩(wěn)定性和染色質(zhì)狀態(tài)調(diào)控
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