寡核苷酸藥物的分類、合成方法以及純化策略

小核酸藥物是目前發(fā)展最為迅速的基因療法之一，作用機(jī)理是直接靶向致病靶基因或RNA片段，通常采用固相亞磷酰胺化學(xué)法來進(jìn)行合成，一般是由12~30個(gè)核苷酸單鏈或雙鏈組成的一類藥物，通過直接靶向致病靶基因或作用于信使 RNA(mRNA) 來調(diào)控致病基因轉(zhuǎn)錄翻譯，具有高特異性。

受限于合成效率以及原料質(zhì)量，并不是所有的寡核苷酸都能合成完整的寡核苷酸鏈，合成得到的初產(chǎn)物會(huì)含有多種不同的雜質(zhì)，其中最主要的雜質(zhì)就是由于單個(gè)或多個(gè)寡核苷酸差異導(dǎo)致的失敗序列（N-x/N+x）。這些N-x與N+x雜質(zhì)的性質(zhì)與目標(biāo)產(chǎn)物非常接近，在分子大小、電荷和疏水性方面的差異通常很小，為純化工藝帶來很大的挑戰(zhàn)，合成后必須應(yīng)用高分辨率純化技術(shù)，才能使目標(biāo)分子與雜質(zhì)分離。

所以寡核苷酸合成之后，如何選擇合適的填料和純化工藝對(duì)于產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)放大都非常重要。目前主流的純化方式主要是陰離子交換層析、反相層析和疏水層析。由于核苷酸序列不同和粗品雜質(zhì)含量的差異，可結(jié)合或選擇其中一種或者兩種方式進(jìn)行純化。

寡核苷酸藥物通常指由化學(xué)合成的12~30個(gè)核苷酸單鏈或雙鏈組成的一類藥物，主要包括反義寡核苷酸 （ASO) 、小干擾RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、小激活RNA (saRNA)、信使RNA (mRNA)、RNA適配體(Aptamer)等。

寡核苷酸藥物與蛋白類和小分子藥物不同之處在于，寡核苷酸藥物并非作用于蛋白，而是可以直接調(diào)控基因的表達(dá)，因此被認(rèn)為是繼小分子藥物、蛋白藥物之后的第三代創(chuàng)新藥物。

寡核苷酸的合成方法目前主要有液相合成、固相合成以及生物合成的方法。其中最主流的合成方法是采用固相合成法，利用自動(dòng)化的設(shè)備通過固相亞磷酰胺化學(xué)法來進(jìn)行合成。

Fig.1所示為合成用單體，主要由堿基、脫氧核糖、5'-DMT和3'端的2-氰乙基以及二異丙胺基組成，而RNA的亞磷酰胺單體中則需要對(duì)2'-OH進(jìn)行保護(hù)，以防止在固相合成中2'-OH與5'-OH發(fā)生交叉反應(yīng)，該保護(hù)基團(tuán)一般為TBDMS。

此外，由于腺嘌呤、胞嘧啶和鳥嘌呤和一些人工堿基存在伯氨基，因此也需要在單元中用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)對(duì)其保護(hù)。

Fig.1 DNA的亞磷酰胺單體

寡核苷酸的固相合成具體過程由4步循環(huán)組成：脫保護(hù)、 偶聯(lián)、氧化和蓋帽。在合成循環(huán)后，需要對(duì)中間產(chǎn)品使用氨水進(jìn)行氨解反應(yīng)，將寡核苷酸從固相載體上切割下來并進(jìn)行基團(tuán)的脫保護(hù)處理。

Fig.2 寡核苷酸合成流程示意圖

使用干燥有機(jī)溶劑與酸液（二氯乙酸）除去核苷酸上的5'-DMT保護(hù)基團(tuán)，暴露5'-OH，以供下一步偶聯(lián)。

單體經(jīng)過活化后被泵入合成柱，脫保護(hù)的5'-OH會(huì)與亞磷酰胺四唑活性中間體，形成新的磷氧鍵，在這一步核苷酸鏈得到延伸。

偶聯(lián)反應(yīng)生成的亞磷酯鍵，易被酸、堿水解，因此需要進(jìn)行氧化或硫化操作，形成磷酸二酯（或硫代膦酸二酯）鍵。

為了防止這些5'的活躍基團(tuán)與下一個(gè)循環(huán)加入的活化亞磷酰胺單體發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生N-1雜質(zhì)，需要對(duì)未參與偶聯(lián)的5'-OH羥基加帽。

受限于反應(yīng)效率及原料純度等，合成的產(chǎn)物中存在多種不同的雜質(zhì)。主要表現(xiàn)為單個(gè)或多個(gè)寡核苷酸的差異（N-x/N+x），保護(hù)基團(tuán)的保留，例如DMT+、3'+產(chǎn)物，以及嘌呤的脫除等。這些基團(tuán)或者序列的改變會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)分子與目標(biāo)產(chǎn)物之間存在性質(zhì)上的差異。主要表現(xiàn)為：

• 磷酸基團(tuán)（Phosphate group）：寡核苷酸所帶靜電荷取決于磷酸或修飾基團(tuán)的數(shù)目、堿基的數(shù)目以及二級(jí)結(jié)構(gòu)是否遮蔽帶電基團(tuán)。通常在變性條件（例pH12）打開氫鍵使結(jié)構(gòu)展開并且堿基不帶電（pH>pKa），以有效區(qū)分N-1雜質(zhì)。

• DMT on/off：DMT是一個(gè)強(qiáng)疏水性基團(tuán)，與反相層析/疏水層析產(chǎn)生相互作用。因此可以用于帶有DMT的全長序列的分離。

• 硫代（Thiolation）：當(dāng)磷酸基團(tuán)中的氧原子被硫原子取代時(shí)，帶負(fù)電的基團(tuán)極性增加，在大多數(shù)pH條件下與陰離子交換填料結(jié)合更強(qiáng)。

• 甲基化（Methylation）：當(dāng)氧原子被甲基取代時(shí)，疏水增強(qiáng)。

因此，在小核酸的純化過程中可以利用上述性質(zhì)差異進(jìn)行分離，通常采用離子交換層析、疏水層析及反相層析并進(jìn)行合理組合。

陰離子層析是一種可以在水相條件下對(duì)寡核苷酸進(jìn)行分離的層析方法，無需使用有機(jī)溶劑，因此無需考慮車間和設(shè)備的防爆。

博格隆BestPoly 15Q是一款聚苯乙烯-二乙烯基苯材質(zhì)的強(qiáng)陰離子填料，平均粒徑15μm，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、剛性強(qiáng)，可在高pH條件下操作，高pH可以避免單鏈自互補(bǔ)或者富含GC寡核苷酸聚集。本案例使用博格隆BestPoly 15Q對(duì)合成后的寡核苷酸進(jìn)行純化，最終純度90%以上樣品占比可達(dá)52%。

Fig.3 BestPoly 15Q純化寡核苷酸

小核酸藥物作為一個(gè)新的生物制藥技術(shù)平臺(tái)，現(xiàn)在已進(jìn)入成熟階段，即將迎來快速發(fā)展。它已經(jīng)展示出一些顛覆性技術(shù)的特質(zhì)，尤其是可能會(huì)改變慢性病的治療理念和策略。這一變化會(huì)帶來單克隆抗體式的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)格局重構(gòu)，今后十年、二十年都是核酸制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重大窗口期。

對(duì)于寡核苷酸生產(chǎn)來說，最為重要的因素是寡核苷酸的合成及合成后的純化，所以選擇一款高效純化填料十分重要。博格隆作為國內(nèi)層析填料生產(chǎn)行業(yè)的龍頭企業(yè)，也在不斷推出適配市場需求的新產(chǎn)品，為客戶提供更多樣化的選擇。

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