熱原及細菌內(nèi)毒素檢測第三期之醫(yī)療器械細菌內(nèi)毒素限值與測試方法詳解
本期文章將繼續(xù)挖掘細菌內(nèi)毒素檢測領(lǐng)域的細節(jié)，同時探討在實際操作中可能遇到的挑戰(zhàn)與解決方案。通過本期內(nèi)容的深入剖析，讀者將能更全面地理解細菌內(nèi)毒素檢測的實踐應(yīng)用與策略優(yōu)化。
Q1：什么時候采用USP通則151家兔熱原試驗是合適的?
對于某些生物制品，21 CFR 610.13（b）要求進行家兔熱原試驗。如果根據(jù)21 CFR 610.9 的規(guī)定，證明有與兔熱原試驗等效的方法，則可免除21 CFR 610.13（b）中的要求。
對于人藥和獸藥，某些USP各論仍要求進行兔熱原試驗。即使有這些專論，如果企業(yè)能證明其熱原檢測方法與之相當(dāng)，也可以用細菌內(nèi)毒素檢測或替代性細胞檢測方法來替代。FDA將根據(jù)具體情況考慮單核細胞活化等替代方法。
對于醫(yī)療器械和藥品物料，公司應(yīng)該評估非細菌內(nèi)毒素?zé)嵩嬖诘娘L(fēng)險。如果風(fēng)險評估顯示非細菌內(nèi)毒素?zé)嵩赡艽嬖�，采用免法熱原測試應(yīng)該是更恰當(dāng)?shù)摹?
細菌內(nèi)毒素含量受到和測試物品理化性質(zhì)相關(guān)的多個因素干擾。如果這些干擾因素不能通過樣品稀釋（最大到MVD稀釋水平）或者其他驗證的樣品制備方法來減少，公司應(yīng)該采用免法熱原測試。
Q2：對于適用于多品系動物的獸藥，如何確定細菌內(nèi)毒素限值是合適的?
對于標明可用于多個物種的獸藥產(chǎn)品，限值應(yīng)以最小物種的最大產(chǎn)品劑量為基礎(chǔ)。如果標簽注明產(chǎn)品可用于幼年和成年動物，則幼年動物被視為最差情況。如果需要用動物的體重來計算劑量，公司應(yīng)使用該物種的平均體重。
關(guān)于一些動物平均體重的清單，請參考FDA指南《WaiversofIn Vivo Demonstration of Bioequivalence o fAnimal Drugs in Soluble Powder Oral Dosage Form Products and Type A Medicated Aricles》。
如需了解該指南中未列出的動物體重，請聯(lián)系FDA獸藥中心（CVM,Center for Veterinary Medicine）。
Q3：醫(yī)療器械的細菌內(nèi)毒素限值是什么?
醫(yī)療器械和放射衛(wèi)生中心（CDRH）采用了以EU/mL為單位的USP細菌內(nèi)毒素參考標準用于醫(yī)療器械提取物限值。USP第<161>章《Transfusion and Infusion Assemblies and Similar Medical Devices》規(guī)定了其范圍內(nèi)醫(yī)療器械的細菌內(nèi)毒素限值。醫(yī)療器械的細菌內(nèi)毒素限值取決于設(shè)備的預(yù)期用途和設(shè)備接觸的物品（如血液、心血管系統(tǒng)、腦脊液、鞘內(nèi)給藥途徑、永久植入設(shè)備和皮下植入設(shè)備）。
對于直接或間接接觸心血管系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)的醫(yī)療器械，采用下述提取量建議，限值為0.5EU/mL或20EU/每器械。對于與腦脊液接觸的器械，限值為0.06EU/mL或2.15EU/每器械。對于直接或間接接觸眼內(nèi)環(huán)境的器械，可能適用較低的細菌內(nèi)毒素限值。有關(guān)具體建議，請聯(lián)系相應(yīng)的審查部門。
為測試準備淋洗液或者萃取液的過程可能因設(shè)備而異。有些醫(yī)療器械可以沖洗，有些可能需要浸泡，而有些則可能需要拆卸。除非其他藥典標準另有規(guī)定，我們建議的沖洗量包括以下內(nèi)容：
(1)每10個測試樣品應(yīng)該用40ml無熱原水來沖洗；
(2)對于異常小或異常大的器械，在選擇淋洗液或者萃取液體積時，可將器械與患者接觸的表面積作為調(diào)整因素。細菌內(nèi)毒素限值可作相應(yīng)調(diào)整。在任何情況下，沖洗/萃取程序都不應(yīng)導(dǎo)致細菌內(nèi)毒素的稀釋超過USP<85>中的建議。對于抑制/增強測試，淋洗液/取液和器械的淋洗物/萃取物都應(yīng)該進行測試。
用于測試或者干擾挑戰(zhàn)的醫(yī)療器械的例子，包括包封抗凝劑、包含重金屬或者粒子的器械。在這些情況下,干擾的處理措施可以包括消解、稀釋和緩沖物的添加，離心或者過濾。
在同一手術(shù)過程中，或在同一手術(shù)部位放置同一器械時，同一制造商生產(chǎn)的同一器械的多個單位通常應(yīng)達到與手術(shù)過程中施用的單一器械相同的細菌內(nèi)毒素限值。如果已知或打算在單個手術(shù)中使用同一器械的多個單位，制造商應(yīng)說明偏離本指南中確定的總體細菌內(nèi)毒素限值的理由。
當(dāng)醫(yī)療器械制造商計劃使用嚴重偏離本指南或公認標準的LAL檢測時，應(yīng)根據(jù)FDCA第 510（k）條提交上市前通知書「510（k）」，或根據(jù)FDCA第515條提交上市前批準申請（PMA）補充文件。重大偏離包括但不一定限于：較高的細菌內(nèi)毒素濃度放行標準，用于抑制/增強測試的樣品少于3批次，較低的細菌內(nèi)毒素靈敏度，器械淋洗方案導(dǎo)致細菌內(nèi)毒素比本指南建議的更大程度的稀釋。
Q4：關(guān)于治療藥品的定期篩選，F(xiàn)DA的期望是什么?
理想情況下，只要在LAL檢測中不存在干擾/增強特性，就應(yīng)篩查未稀釋的產(chǎn)品。但是，有些產(chǎn)品處方中的成分會干擾LAL測試。對于此類處方，USP建議對產(chǎn)品進行稀釋，以克服干擾或增強特性。計算出的 MVD是可以檢測到細菌內(nèi)毒素限值的樣品稀釋度，但不應(yīng)作為常規(guī)檢測稀釋度。當(dāng)產(chǎn)品在開發(fā)過程中遇到干擾時，F(xiàn)DA建議制藥公司確定產(chǎn)品最低稀釋濃度以抵消干擾情況。
FDA建議企業(yè)以略高于中和干擾的產(chǎn)品稀釋度開始后續(xù)的產(chǎn)品篩選。例如，如果產(chǎn)品的MVD為1:100，而產(chǎn)品在1:10時顯示出抑制作用，但在1:20時沒有，則最好以1:30的稀釋度篩選產(chǎn)品。如果在這個水平上檢測到細菌內(nèi)毒素，那么企業(yè)就應(yīng)該對產(chǎn)品進行全面檢查，來測量細菌內(nèi)毒素的準確數(shù)值。
Q5：細菌內(nèi)毒素工作標準品(CSE)是否仍可用于細菌內(nèi)毒素檢測？
細菌內(nèi)毒素工作標準品(CSE)是指除國際或國家參考標準以外的細菌內(nèi)毒素制劑，其校準可追溯至國際參考細菌內(nèi)毒素標準。CSE可以是二級或三級標準品，通常由LAL試劑制造商生產(chǎn)和標定，用于在規(guī)定的檢測條件下與特定批次的試劑配合使用。
▲細菌內(nèi)毒素工作標準品(CSE)
CSE已成為制備標準曲線校準物和用作化驗對照的公認來源，為LAL用戶節(jié)省了成本，并有助于保存一級標準物質(zhì)的庫存。FDA鼓勵繼續(xù)使用根據(jù)國際細菌內(nèi)毒素參考標準進行適當(dāng)校準的CSE。
細菌內(nèi)毒素檢測領(lǐng)域充滿了挑戰(zhàn)與機遇，隨著科技進步與監(jiān)管要求的持續(xù)更新，其檢測方法和標準正不斷完善。盡管本期文章已深入解析多個關(guān)鍵問題，但細菌內(nèi)毒素檢測的實踐應(yīng)用與策略優(yōu)化依然是一個不斷發(fā)展的過程。接下來的文章中，我們將進一步挖掘該領(lǐng)域的深度與廣度，探討更多實際操作挑戰(zhàn)與解決方案，并緊跟最新研究成果和行業(yè)動態(tài)，為讀者呈現(xiàn)更多前沿信息與洞見，敬請期待。
