m6A RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3抑制劑在體內(nèi)和體外抑制前列腺癌進(jìn)展
前列腺癌（Prostate cancer，PCa)是全球男性中最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致男性癌癥死亡的第二大原因。盡管雄激素受體（Androgen receptor，AR）信號通路在前列腺癌進(jìn)展中至關(guān)重要，但長期雄激素剝奪治療（androgen deprivation therapy，ADT）最終會失敗，導(dǎo)致致命的去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）。目前，AR靶向治療的抗性導(dǎo)致前列腺癌的治療仍存在挑戰(zhàn)，尋找新的治療靶點(diǎn)變得尤為重要。近年來表觀遺傳學(xué)的快速發(fā)展為研究 PCa 的進(jìn)展、耐藥性和潛在治療靶點(diǎn)提供了新的途徑。
RNA修飾是一種重要的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，RNA N6-甲基腺苷（m6A）是人類最豐富的RNA修飾類型，在mRNA剪接、翻譯和降解的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起關(guān)鍵作用。在許多癌癥類型中，m6A調(diào)節(jié)酶的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥性和癌癥干細(xì)胞自我更新有關(guān)。m6A調(diào)控因子METTL3是前列腺癌（PCa）多種進(jìn)展過程中的重要調(diào)控基因。已有報(bào)道稱METTL3抑制劑在某些癌癥類型中具有強(qiáng)大的腫瘤抑制能力。然而，METTL3抑制劑對PCa進(jìn)展的詳細(xì)影響和機(jī)制以及它們與其他藥物的潛在協(xié)同作用尚不清楚。
2024年10月，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所Wu Meng團(tuán)隊(duì)、北京醫(yī)院侯惠民團(tuán)隊(duì)和浙江師范大學(xué)周金明團(tuán)隊(duì)合作在《Biomedicine & Pharmacotherapy》期刊發(fā)表題為“METTL3 inhibitor suppresses the progression of prostate cancer via IGFBP3/AKT pathway and synergizes with PARP inhibitor”的科研成果。研究通過免疫組化染色、Western blot、qRT-PCR等方法揭示前列腺癌PCa中METTL3 過表達(dá)并與不良預(yù)后相關(guān)。研究還表明MTTTL3 抑制劑STM2457可以降低PCa細(xì)胞的m6A水平，從而抑制其增殖、集落形成、遷移、侵襲和干性。此外，STM2457在體內(nèi)抑制細(xì)胞來源的異種移植物（CDX）和患者來源的異種移植物（PDX）PCa 模型的進(jìn)展。MeRIP-seq分析與生物學(xué)驗(yàn)證相結(jié)合揭示STM2457主要通過 IGFBP3/AKT 通路影響PCa細(xì)胞中的多個生物過程。TM2457誘導(dǎo)DNA損傷，并在體外和體內(nèi)顯示出與 PARP 抑制劑奧拉帕尼（Olaparib）的協(xié)同抗PCa作用�？傮w而言，本研究為靶向 RNA m6A 修飾治療 PCa 提供了一種新的治療策略。
標(biāo)題：METTL3 inhibitor suppresses the progression of prostate cancer via IGFBP3/AKT pathway and synergizes with PARP inhibitor（METTL3抑制劑通過IGFBP3/AKT通路抑制前列腺癌進(jìn)展并與PARP抑制劑協(xié)同作用）
期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy
影響因子： IF 6.9
技術(shù)平臺：MeRIP-seq、RNA-seq
研究設(shè)計(jì)：
圖形摘要
結(jié)果圖形：
1. METTL3 在大多數(shù) PCa 腫瘤和細(xì)胞系中過表達(dá)
圖1. 在前列腺癌（PCa）腫瘤和細(xì)胞系中METTL3的過表達(dá)和m6A水平。
A. 通過免疫組化（IHC）染色檢測了74名PCa患者的腫瘤和相鄰正常組織中METTL3的蛋白表達(dá)水平
B. 對圖1A中IHC結(jié)果的定量分析。
C. 在TCGA數(shù)據(jù)庫中，檢測了PCa腫瘤和相鄰正常組織中METTL3的mRNA表達(dá)水平。
D. 通過Western blot檢測了12名PCa患者的腫瘤和相鄰正常組織中METTL3的蛋白表達(dá)水平。
E. 對圖1D中Western blot結(jié)果的定量分析。
F. 通過qRT-PCR檢測了12名PCa患者的腫瘤和相鄰正常組織中METTL3的mRNA表達(dá)水平。
G. 檢測12名PCa患者的腫瘤和相鄰正常組織中總RNA的m6A水平。
H. 通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析，高M(jìn)ETTL3表達(dá)與PCa的預(yù)后不良顯著相關(guān)，P＜0.05。
I. 通過Western blot檢測了5種不同的PCa細(xì)胞系和1種正常成人前列腺上皮細(xì)胞系中METTL3的蛋白水平。
J. 對圖1I中Western blot結(jié)果的定量分析。
K. qRT-PCR檢測5種不同PCa細(xì)胞系和1種正常成人前列腺上皮細(xì)胞系中METTL3 mRNA表達(dá)水平
L. 檢測了5種不同PCa細(xì)胞系和1種正常成人前列腺上皮細(xì)胞系中總RNA的m6A水平。（實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)。結(jié)果表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001與對照組相比。）
2. METTL3抑制劑在體外抑制PCa細(xì)胞和類器官活力
圖2：STM2457對體外前列腺癌細(xì)胞和類器官活力的影響。
A. DU145、22Rv1、LNCaP、C4-2和PC-3細(xì)胞用DMSO、STM2457 1.25μM、2.5μM、5.0μM和10.0μM處理24小時(shí)，檢測不同細(xì)胞系和不同處理組的總RNA m6A水平。
B. 22Rv1、LNCaP、C4-2、DU145和PC-3細(xì)胞用不同濃度的STM2457處理6天，通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖。
C. 用DMSO、STM2457 1.25μM、2.5μM、5.0μM、10.0μM和20.0μM處理22Rv1、LNCaP、C4-2、DU145和PC-3細(xì)胞12-14天，進(jìn)行結(jié)晶紫染色法檢測。
D. 對圖2C中集落形成結(jié)果的定量分析。
E. 用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM處理22Rv1和DU145細(xì)胞24小時(shí)，通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移活性。
F. 對圖2E中Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果的定量分析。
G. 用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM處理22Rv1和DU145細(xì)胞24小時(shí)，通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲活性。
H. 對圖2G中Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果的定量分析。
I. 用DMSO、STM2457 5.0μM和20.0μM處理22Rv1和DU145細(xì)胞48小時(shí)，通過高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞運(yùn)動跟蹤。
J. 用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM處理22Rv1和DU145細(xì)胞2周，進(jìn)行成球試驗(yàn)(spheroid formation assay)檢測。
K. 3個前列腺癌患者源類器官用DMSO、STM2457 2.5μM、5.0μM和10.0μM處理約10天，然后通過顯微鏡觀察。
L. 3個前列腺癌患者源類器官用不同濃度的STM2457處理約10天，檢測類器官活力。
3. METTL3抑制劑在體內(nèi)抑制PCa進(jìn)展
圖3：STM2457對前列腺癌CDX和PDX模型體內(nèi)進(jìn)展的作用。
A. 22Rv1細(xì)胞異種移植腫瘤經(jīng)對照或每天50mg/kg STM2457處理3周，最后一天拍攝腫瘤照片（n=4）。
B. 每隔一天監(jiān)測一次腫瘤體積增長。
C. 最后一天用電子秤測量腫瘤重量。
D. 每隔一天用電子秤監(jiān)測小鼠體重。
E. 檢測腫瘤組織的總RNA m6A水平。
F. 對收獲的腫瘤進(jìn)行增殖（Ki-67）和凋亡（裂解的caspase 3）水平的免疫組化分析，
G. 對圖3F中IHC結(jié)果的定量分析。
H. 前列腺癌患者腫瘤的異種移植腫瘤經(jīng)對照或每天50 mg/kg STM2457處理3周，最后一天拍攝腫瘤照片（n=5）。
I. 每三天監(jiān)測一次腫瘤體積增長。
J. 最后一天用電子秤測量腫瘤重量。
K. 每三天用電子秤監(jiān)測小鼠體重。
L. 檢測腫瘤組織的總RNA m6A水平。
M. 對收獲的腫瘤進(jìn)行增殖（Ki-67）、神經(jīng)內(nèi)分泌分化（SOX2）和DNA損傷（γ-H2AX）水平的免疫組化分析。
N. 對圖3M中IHC結(jié)果的定量分析。
4. PCa細(xì)胞中受METTL3抑制劑影響的信號通路
圖4：STM2457導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞的全基因組m6A修飾和轉(zhuǎn)錄組變化。
A. 在用DMSO（n=3）或STM2457 10μM（n=3）處理的22Rv1細(xì)胞中進(jìn)行MeRIP-seq分析，不同處理組的m6A peaks強(qiáng)度以小提琴圖表示。
B. 差異m6A峰（n=25369）分布在5'UTR、3'UTR、起始密碼子、終止密碼子、內(nèi)含子、間隔區(qū)或CDS區(qū)域。
C. 維恩圖展示通過RNA-seq和MeRIP-seq檢測的顯著表達(dá)或m6A峰變化（FDR<0.05, p<0.05）的基因數(shù)量。
D. DMSO和STM2457組中差異m6A標(biāo)記基因熱圖。
E. 在DMSO與STM2457組中，m6A峰和mRNA表達(dá)水平顯著變化的基因被分為4類：hypo-down（m6A峰下調(diào)，mRNA下調(diào)）；hypo-up（m6A峰下調(diào)，mRNA上調(diào)）；hyper-down（m6A峰上調(diào)，mRNA下調(diào)）；hyper-up（m6A峰上調(diào)，mRNA上調(diào)）。
F-G. 下調(diào)最多的前10個編碼基因的m6A峰（F）和最顯著的mRNA表達(dá)水平變化（G）。
H. DMSO和STM2457組轉(zhuǎn)錄組的KEGG分析。
I. GSEA揭示STM2457在22Rv1細(xì)胞中顯著下調(diào)細(xì)胞周期、氧化磷酸化和DNA復(fù)制途徑。
5. IGFBP3/AKT通路是METTL3抑制劑抗前列腺癌（PCa）效果所必需的
圖5：STM2457通過IGFBP3/AKT通路抑制前列腺癌細(xì)胞活力。
A. MeRIP-seq檢測22Rv1細(xì)胞中DMSO或STM2457組IGFBP3 mRNA 3'UTR的m6A峰分布差異。
B. 22Rv1細(xì)胞用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM處理48小時(shí)，通過qRT-PCR檢測IGFBP3 mRNA水平，并與GAPDH歸一化。
C. C4-2細(xì)胞用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM處理48小時(shí)，通過qRT-PCR檢測IGFBP3 mRNA水平，并與GAPDH歸一化。
D. LNCaP細(xì)胞用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM處理48小時(shí)，通過qRT-PCR檢測IGFBP3 mRNA水平，并與GAPDH歸一化。
E. C4-2和22Rv1細(xì)胞用DMSO、STM2457 2.5μM、5.0μM和10.0μM處理48小時(shí)，通過western blot分析檢測IGFBP3蛋白水平。
F. 對圖5E中western blot結(jié)果的定量分析。
G. C4-2和22Rv1細(xì)胞用DMSO或STM2457 10.0μM處理48小時(shí)，通過western blot分析檢測p-AKT、AKT和IGFBP3蛋白水平。
H. 對圖5G中western blot結(jié)果的定量分析。
I. C4-2和22Rv1細(xì)胞用si-IGFBP3或si-NC處理24小時(shí)，通過qRT-PCR檢測IGFBP3 mRNA水平，并與GAPDH歸一化。
J. C4-2和22Rv1細(xì)胞用si-IGFBP3或si-NC處理24小時(shí)，通過western blot分析檢測IGFBP3蛋白水平。
K. C4-2和22Rv1細(xì)胞用si-IGFBP3或si-NC處理24小時(shí)，然后用DMSO或STM2457 10μM處理24小時(shí)，通過western blot分析檢測p-AKT、AKT和IGFBP3蛋白水平。
L. C4-2細(xì)胞用si-IGFBP3或si-NC處理24小時(shí)，然后用STM2457 5.0μM處理24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)，通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力。
M. 22Rv1細(xì)胞用si-IGFBP3或si-NC處理24小時(shí)，然后用STM2457 5.0μM處理24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)，通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力。
N. C4-2和22Rv1細(xì)胞用si-IGFBP3或si-NC處理24小時(shí)，然后用DMSO或STM2457 5.0μM處理12-14天，進(jìn)行結(jié)晶紫染色分析。
O. 對圖5N中集落形成結(jié)果的定量分析。
6. METTL3抑制劑與PARP抑制劑聯(lián)合使用在體外顯示出增強(qiáng)的抗PCa活性
圖6：STM2457在體外與PARP抑制劑顯示出協(xié)同抗前列腺癌效果。
A. C4-2和22Rv1細(xì)胞用DMSO或STM2457 10.0μM處理72小時(shí)，通過western blot分析檢測p-AKT、AKT和γ-H2AX蛋白水平。
B. 對圖6A中相對γ-H2AX蛋白水平的定量分析。
C. 22Rv1細(xì)胞用DMSO或STM2457 10.0μM處理72小時(shí)，通過免疫熒光檢測γ-H2AX蛋白水平。
D. 22Rv1細(xì)胞用指定濃度的STM2457與奧拉帕尼聯(lián)合處理144小時(shí)，通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖抑制活性。
E. 計(jì)算STM2457與奧拉帕尼在22Rv1細(xì)胞中的協(xié)同得分。
F. C4-2細(xì)胞用指定濃度的STM2457與奧拉帕尼聯(lián)合處理144小時(shí)，通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖抑制活性。
G. 計(jì)算STM2457與奧拉帕尼在C4-2細(xì)胞中的協(xié)同得分。
H. 22Rv1和DU145細(xì)胞用DMSO、STM2457 5.0μM、奧拉帕尼5.0μM和STM2457 5.0μM與奧拉帕尼5.0μM聯(lián)合處理12-14天，進(jìn)行結(jié)晶紫染色。
I. 對圖6H中集落形成結(jié)果的定量分析。
J. 22Rv1和DU145細(xì)胞用DMSO、STM2457 5.0μM、奧拉帕尼5.0μM和STM2457 5.0μM與奧拉帕尼5.0μM聯(lián)合處理24小時(shí)，通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移活性。
K. 22Rv1和DU145細(xì)胞用DMSO、STM2457 5.0μM、奧拉帕尼5.0μM和STM2457 5.0μM與奧拉帕尼5.0μM聯(lián)合處理24小時(shí)，通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲活性。
L. 22Rv1和DU145細(xì)胞用DMSO、STM2457 5.0μM、奧拉帕尼5.0μM和STM2457 5.0μM與奧拉帕尼5.0μM聯(lián)合處理48小時(shí)，然后通過高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)進(jìn)行18小時(shí)的細(xì)胞運(yùn)動跟蹤。
M. 通過高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)分析圖6L中22Rv1和DU145細(xì)胞的運(yùn)動位移和速度。
7. METTL3抑制劑與PARP抑制劑協(xié)同作用，抑制體內(nèi)PCa進(jìn)展
B. 每三天監(jiān)測一次腫瘤體積增長。
C. 最后一天用電子秤測量腫瘤重量。
D. 每三天用電子秤監(jiān)測小鼠體重。
E. 對收獲的腫瘤進(jìn)行增殖（Ki-67）和凋亡（裂解的caspase 3）水平的免疫組化分析。
F. 對圖7E中IHC結(jié)果的定量分析。
易小結(jié)
本研究地分析了METTL3抑制劑STM2457在不同細(xì)胞系、患者來源器官類器官(PDO)、細(xì)胞源異種移植模型(CDX)和患者源異種移植模型(PDX)中的前列腺癌(PCa)抑制活性。STM2457抑制了IGFBP3 3'UTR的m6A修飾，并促進(jìn)IGFBP3的穩(wěn)定和過表達(dá)。隨后，IGFBP3降低了AKT的磷酸化水平，進(jìn)而抑制METTL3過表達(dá)的PCa進(jìn)展。此外STM2457誘導(dǎo)了DNA損傷，并在體外和體內(nèi)均顯示出與PARP抑制劑的協(xié)同抗PCa效果。本研究首次證明了METTL3抑制劑在體外和體內(nèi)都能抑制PCa進(jìn)展，并為進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)提供了有意義的參考。
參考文獻(xiàn)：
Chen X, Wang M, Wang H, Yang J, Li X, Zhang R, Ding X, Hou H, Zhou J, Wu M. METTL3 inhibitor suppresses the progression of prostate cancer via IGFBP3/AKT pathway and synergizes with PARP inhibitor. Biomed Pharmacother. 2024 Sep 3;179:117366. pii: S0753-3322(24)01251-4. doi: 10.1016/j.biopha.2024.117366. PubMed PMID: 39232384.
RNA修飾是一種重要的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，RNA N6-甲基腺苷（m6A）是人類最豐富的RNA修飾類型，在mRNA剪接、翻譯和降解的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起關(guān)鍵作用。在許多癌癥類型中，m6A調(diào)節(jié)酶的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥性和癌癥干細(xì)胞自我更新有關(guān)。m6A調(diào)控因子METTL3是前列腺癌（PCa）多種進(jìn)展過程中的重要調(diào)控基因。已有報(bào)道稱METTL3抑制劑在某些癌癥類型中具有強(qiáng)大的腫瘤抑制能力。然而，METTL3抑制劑對PCa進(jìn)展的詳細(xì)影響和機(jī)制以及它們與其他藥物的潛在協(xié)同作用尚不清楚。
2024年10月，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所Wu Meng團(tuán)隊(duì)、北京醫(yī)院侯惠民團(tuán)隊(duì)和浙江師范大學(xué)周金明團(tuán)隊(duì)合作在《Biomedicine & Pharmacotherapy》期刊發(fā)表題為“METTL3 inhibitor suppresses the progression of prostate cancer via IGFBP3/AKT pathway and synergizes with PARP inhibitor”的科研成果。研究通過免疫組化染色、Western blot、qRT-PCR等方法揭示前列腺癌PCa中METTL3 過表達(dá)并與不良預(yù)后相關(guān)。研究還表明MTTTL3 抑制劑STM2457可以降低PCa細(xì)胞的m6A水平，從而抑制其增殖、集落形成、遷移、侵襲和干性。此外，STM2457在體內(nèi)抑制細(xì)胞來源的異種移植物（CDX）和患者來源的異種移植物（PDX）PCa 模型的進(jìn)展。MeRIP-seq分析與生物學(xué)驗(yàn)證相結(jié)合揭示STM2457主要通過 IGFBP3/AKT 通路影響PCa細(xì)胞中的多個生物過程。TM2457誘導(dǎo)DNA損傷，并在體外和體內(nèi)顯示出與 PARP 抑制劑奧拉帕尼（Olaparib）的協(xié)同抗PCa作用�？傮w而言，本研究為靶向 RNA m6A 修飾治療 PCa 提供了一種新的治療策略。
標(biāo)題：METTL3 inhibitor suppresses the progression of prostate cancer via IGFBP3/AKT pathway and synergizes with PARP inhibitor（METTL3抑制劑通過IGFBP3/AKT通路抑制前列腺癌進(jìn)展并與PARP抑制劑協(xié)同作用）
影響因子： IF 6.9
技術(shù)平臺：MeRIP-seq、RNA-seq
研究設(shè)計(jì)：
- 使用免疫組化染色、Western blot、qRT-PCR等方法檢測METTL3在前列腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平。
- 通過MeRIP-seq分析和生物學(xué)驗(yàn)證，研究STM2457對前列腺癌細(xì)胞中m6A修飾的影響。
- 在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動物模型中評估STM2457對前列腺癌進(jìn)展的影響。
- 通過藥物協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)，研究STM2457與PARP抑制劑的聯(lián)合治療效果。
圖形摘要
結(jié)果圖形：
1. METTL3 在大多數(shù) PCa 腫瘤和細(xì)胞系中過表達(dá)
圖1. 在前列腺癌（PCa）腫瘤和細(xì)胞系中METTL3的過表達(dá)和m6A水平。
B. 對圖1A中IHC結(jié)果的定量分析。
C. 在TCGA數(shù)據(jù)庫中，檢測了PCa腫瘤和相鄰正常組織中METTL3的mRNA表達(dá)水平。
D. 通過Western blot檢測了12名PCa患者的腫瘤和相鄰正常組織中METTL3的蛋白表達(dá)水平。
E. 對圖1D中Western blot結(jié)果的定量分析。
F. 通過qRT-PCR檢測了12名PCa患者的腫瘤和相鄰正常組織中METTL3的mRNA表達(dá)水平。
G. 檢測12名PCa患者的腫瘤和相鄰正常組織中總RNA的m6A水平。
H. 通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析，高M(jìn)ETTL3表達(dá)與PCa的預(yù)后不良顯著相關(guān)，P＜0.05。
I. 通過Western blot檢測了5種不同的PCa細(xì)胞系和1種正常成人前列腺上皮細(xì)胞系中METTL3的蛋白水平。
J. 對圖1I中Western blot結(jié)果的定量分析。
K. qRT-PCR檢測5種不同PCa細(xì)胞系和1種正常成人前列腺上皮細(xì)胞系中METTL3 mRNA表達(dá)水平
L. 檢測了5種不同PCa細(xì)胞系和1種正常成人前列腺上皮細(xì)胞系中總RNA的m6A水平。（實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)。結(jié)果表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001與對照組相比。）
2. METTL3抑制劑在體外抑制PCa細(xì)胞和類器官活力
圖2：STM2457對體外前列腺癌細(xì)胞和類器官活力的影響。
B. 22Rv1、LNCaP、C4-2、DU145和PC-3細(xì)胞用不同濃度的STM2457處理6天，通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖。
C. 用DMSO、STM2457 1.25μM、2.5μM、5.0μM、10.0μM和20.0μM處理22Rv1、LNCaP、C4-2、DU145和PC-3細(xì)胞12-14天，進(jìn)行結(jié)晶紫染色法檢測。
D. 對圖2C中集落形成結(jié)果的定量分析。
E. 用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM處理22Rv1和DU145細(xì)胞24小時(shí)，通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移活性。
F. 對圖2E中Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果的定量分析。
G. 用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM處理22Rv1和DU145細(xì)胞24小時(shí)，通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲活性。
H. 對圖2G中Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果的定量分析。
I. 用DMSO、STM2457 5.0μM和20.0μM處理22Rv1和DU145細(xì)胞48小時(shí)，通過高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞運(yùn)動跟蹤。
J. 用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM處理22Rv1和DU145細(xì)胞2周，進(jìn)行成球試驗(yàn)(spheroid formation assay)檢測。
K. 3個前列腺癌患者源類器官用DMSO、STM2457 2.5μM、5.0μM和10.0μM處理約10天，然后通過顯微鏡觀察。
L. 3個前列腺癌患者源類器官用不同濃度的STM2457處理約10天，檢測類器官活力。
3. METTL3抑制劑在體內(nèi)抑制PCa進(jìn)展
圖3：STM2457對前列腺癌CDX和PDX模型體內(nèi)進(jìn)展的作用。
B. 每隔一天監(jiān)測一次腫瘤體積增長。
C. 最后一天用電子秤測量腫瘤重量。
D. 每隔一天用電子秤監(jiān)測小鼠體重。
E. 檢測腫瘤組織的總RNA m6A水平。
F. 對收獲的腫瘤進(jìn)行增殖（Ki-67）和凋亡（裂解的caspase 3）水平的免疫組化分析，
G. 對圖3F中IHC結(jié)果的定量分析。
H. 前列腺癌患者腫瘤的異種移植腫瘤經(jīng)對照或每天50 mg/kg STM2457處理3周，最后一天拍攝腫瘤照片（n=5）。
I. 每三天監(jiān)測一次腫瘤體積增長。
J. 最后一天用電子秤測量腫瘤重量。
K. 每三天用電子秤監(jiān)測小鼠體重。
L. 檢測腫瘤組織的總RNA m6A水平。
M. 對收獲的腫瘤進(jìn)行增殖（Ki-67）、神經(jīng)內(nèi)分泌分化（SOX2）和DNA損傷（γ-H2AX）水平的免疫組化分析。
N. 對圖3M中IHC結(jié)果的定量分析。
4. PCa細(xì)胞中受METTL3抑制劑影響的信號通路
圖4：STM2457導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞的全基因組m6A修飾和轉(zhuǎn)錄組變化。
B. 差異m6A峰（n=25369）分布在5'UTR、3'UTR、起始密碼子、終止密碼子、內(nèi)含子、間隔區(qū)或CDS區(qū)域。
C. 維恩圖展示通過RNA-seq和MeRIP-seq檢測的顯著表達(dá)或m6A峰變化（FDR<0.05, p<0.05）的基因數(shù)量。
D. DMSO和STM2457組中差異m6A標(biāo)記基因熱圖。
E. 在DMSO與STM2457組中，m6A峰和mRNA表達(dá)水平顯著變化的基因被分為4類：hypo-down（m6A峰下調(diào)，mRNA下調(diào)）；hypo-up（m6A峰下調(diào)，mRNA上調(diào)）；hyper-down（m6A峰上調(diào)，mRNA下調(diào)）；hyper-up（m6A峰上調(diào)，mRNA上調(diào)）。
F-G. 下調(diào)最多的前10個編碼基因的m6A峰（F）和最顯著的mRNA表達(dá)水平變化（G）。
H. DMSO和STM2457組轉(zhuǎn)錄組的KEGG分析。
I. GSEA揭示STM2457在22Rv1細(xì)胞中顯著下調(diào)細(xì)胞周期、氧化磷酸化和DNA復(fù)制途徑。
5. IGFBP3/AKT通路是METTL3抑制劑抗前列腺癌（PCa）效果所必需的
圖5：STM2457通過IGFBP3/AKT通路抑制前列腺癌細(xì)胞活力。
B. 22Rv1細(xì)胞用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM處理48小時(shí)，通過qRT-PCR檢測IGFBP3 mRNA水平，并與GAPDH歸一化。
C. C4-2細(xì)胞用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM處理48小時(shí)，通過qRT-PCR檢測IGFBP3 mRNA水平，并與GAPDH歸一化。
D. LNCaP細(xì)胞用DMSO、STM2457 2.5μM和10.0μM處理48小時(shí)，通過qRT-PCR檢測IGFBP3 mRNA水平，并與GAPDH歸一化。
E. C4-2和22Rv1細(xì)胞用DMSO、STM2457 2.5μM、5.0μM和10.0μM處理48小時(shí)，通過western blot分析檢測IGFBP3蛋白水平。
F. 對圖5E中western blot結(jié)果的定量分析。
G. C4-2和22Rv1細(xì)胞用DMSO或STM2457 10.0μM處理48小時(shí)，通過western blot分析檢測p-AKT、AKT和IGFBP3蛋白水平。
H. 對圖5G中western blot結(jié)果的定量分析。
I. C4-2和22Rv1細(xì)胞用si-IGFBP3或si-NC處理24小時(shí)，通過qRT-PCR檢測IGFBP3 mRNA水平，并與GAPDH歸一化。
J. C4-2和22Rv1細(xì)胞用si-IGFBP3或si-NC處理24小時(shí)，通過western blot分析檢測IGFBP3蛋白水平。
K. C4-2和22Rv1細(xì)胞用si-IGFBP3或si-NC處理24小時(shí)，然后用DMSO或STM2457 10μM處理24小時(shí)，通過western blot分析檢測p-AKT、AKT和IGFBP3蛋白水平。
L. C4-2細(xì)胞用si-IGFBP3或si-NC處理24小時(shí)，然后用STM2457 5.0μM處理24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)，通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力。
M. 22Rv1細(xì)胞用si-IGFBP3或si-NC處理24小時(shí)，然后用STM2457 5.0μM處理24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí)，通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力。
N. C4-2和22Rv1細(xì)胞用si-IGFBP3或si-NC處理24小時(shí)，然后用DMSO或STM2457 5.0μM處理12-14天，進(jìn)行結(jié)晶紫染色分析。
O. 對圖5N中集落形成結(jié)果的定量分析。
6. METTL3抑制劑與PARP抑制劑聯(lián)合使用在體外顯示出增強(qiáng)的抗PCa活性
圖6：STM2457在體外與PARP抑制劑顯示出協(xié)同抗前列腺癌效果。
B. 對圖6A中相對γ-H2AX蛋白水平的定量分析。
C. 22Rv1細(xì)胞用DMSO或STM2457 10.0μM處理72小時(shí)，通過免疫熒光檢測γ-H2AX蛋白水平。
D. 22Rv1細(xì)胞用指定濃度的STM2457與奧拉帕尼聯(lián)合處理144小時(shí)，通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖抑制活性。
E. 計(jì)算STM2457與奧拉帕尼在22Rv1細(xì)胞中的協(xié)同得分。
F. C4-2細(xì)胞用指定濃度的STM2457與奧拉帕尼聯(lián)合處理144小時(shí)，通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖抑制活性。
G. 計(jì)算STM2457與奧拉帕尼在C4-2細(xì)胞中的協(xié)同得分。
H. 22Rv1和DU145細(xì)胞用DMSO、STM2457 5.0μM、奧拉帕尼5.0μM和STM2457 5.0μM與奧拉帕尼5.0μM聯(lián)合處理12-14天，進(jìn)行結(jié)晶紫染色。
I. 對圖6H中集落形成結(jié)果的定量分析。
J. 22Rv1和DU145細(xì)胞用DMSO、STM2457 5.0μM、奧拉帕尼5.0μM和STM2457 5.0μM與奧拉帕尼5.0μM聯(lián)合處理24小時(shí)，通過Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移活性。
K. 22Rv1和DU145細(xì)胞用DMSO、STM2457 5.0μM、奧拉帕尼5.0μM和STM2457 5.0μM與奧拉帕尼5.0μM聯(lián)合處理24小時(shí)，通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲活性。
L. 22Rv1和DU145細(xì)胞用DMSO、STM2457 5.0μM、奧拉帕尼5.0μM和STM2457 5.0μM與奧拉帕尼5.0μM聯(lián)合處理48小時(shí)，然后通過高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)進(jìn)行18小時(shí)的細(xì)胞運(yùn)動跟蹤。
M. 通過高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)分析圖6L中22Rv1和DU145細(xì)胞的運(yùn)動位移和速度。
7. METTL3抑制劑與PARP抑制劑協(xié)同作用，抑制體內(nèi)PCa進(jìn)展
圖7：STM2457在體內(nèi)與PARP抑制劑顯示出協(xié)同抗前列腺癌效果。
A. 22Rv1細(xì)胞的異種移植腫瘤用空白對照、每天50mg/kg STM2457、每天50毫克/千克奧拉帕尼，以及每天50 mg/kg STM2457與50 mg/kg奧拉帕尼聯(lián)合處理3周，最后一天拍攝腫瘤照片（n=5）。B. 每三天監(jiān)測一次腫瘤體積增長。
C. 最后一天用電子秤測量腫瘤重量。
D. 每三天用電子秤監(jiān)測小鼠體重。
E. 對收獲的腫瘤進(jìn)行增殖（Ki-67）和凋亡（裂解的caspase 3）水平的免疫組化分析。
F. 對圖7E中IHC結(jié)果的定量分析。
易小結(jié)
本研究地分析了METTL3抑制劑STM2457在不同細(xì)胞系、患者來源器官類器官(PDO)、細(xì)胞源異種移植模型(CDX)和患者源異種移植模型(PDX)中的前列腺癌(PCa)抑制活性。STM2457抑制了IGFBP3 3'UTR的m6A修飾，并促進(jìn)IGFBP3的穩(wěn)定和過表達(dá)。隨后，IGFBP3降低了AKT的磷酸化水平，進(jìn)而抑制METTL3過表達(dá)的PCa進(jìn)展。此外STM2457誘導(dǎo)了DNA損傷，并在體外和體內(nèi)均顯示出與PARP抑制劑的協(xié)同抗PCa效果。本研究首次證明了METTL3抑制劑在體外和體內(nèi)都能抑制PCa進(jìn)展，并為進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)提供了有意義的參考。
參考文獻(xiàn)：
Chen X, Wang M, Wang H, Yang J, Li X, Zhang R, Ding X, Hou H, Zhou J, Wu M. METTL3 inhibitor suppresses the progression of prostate cancer via IGFBP3/AKT pathway and synergizes with PARP inhibitor. Biomed Pharmacother. 2024 Sep 3;179:117366. pii: S0753-3322(24)01251-4. doi: 10.1016/j.biopha.2024.117366. PubMed PMID: 39232384.
標(biāo)簽：
RNA甲基化
- Nature文獻(xiàn)解讀：WGBS揭示最全正常人類細(xì)胞類型的綜合DNA甲基化圖譜
- 文獻(xiàn)解讀：表觀基因組-微生物組軸揭示腸道菌群的宿主調(diào)控
- RNA-BS揭示動物不同發(fā)育階段的mRNA m5C甲基化圖譜和調(diào)控機(jī)制
- 單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析揭示與胰腺癌預(yù)后不良相關(guān)的中間態(tài)癌細(xì)胞群
- 空間轉(zhuǎn)錄組系列十月高分文獻(xiàn)速遞
- 卵巢發(fā)育和衰老的m6A 甲基化揭示RNA穩(wěn)定性和染色質(zhì)狀態(tài)調(diào)控
- SSR分子標(biāo)記檢測服務(wù)的核心優(yōu)勢及應(yīng)用
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