美白功效體外評估的可視化技術(shù)3D黑色素表皮模型的介紹
東方女性以白為美，膚色白皙常常與青春貌美聯(lián)系在一起，我國更是有“一白遮三丑”的俗語，因此美白功效產(chǎn)品一直是化妝品研發(fā)的熱點。隨著合成生物學(xué)蓬勃發(fā)展以及《化妝品注冊備案管理辦法》中對新原料的規(guī)定，對美白新原料的研發(fā)和功效驗證變得更加炙手可熱。在美白化妝品原料或產(chǎn)品研發(fā)階段，通常會采用體外試驗方法評估其美白功效，主要包括基于酪氨酸酶活性生化方法、2D單層黑色素細(xì)胞生物學(xué)方法，體外重建3D皮膚模型替代方法等，不同評估方法在原料/配方產(chǎn)品美白功效篩選的不同階段發(fā)揮著不同作用，總體上，美白原料、配方產(chǎn)品功效篩選邏輯就像金字塔一樣如圖1，比如基于重建3D黑色素表皮模型篩選適用于已初步確認(rèn)有一定美白作用的原料/配方產(chǎn)品篩選。
重建3D黑色素表皮模型以人源正常組織角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素細(xì)胞為種子以一定的比例接種于特定生長環(huán)境中，經(jīng)過浸沒培養(yǎng)和氣液培養(yǎng)增殖分化出類似于正常人表皮復(fù)層組織結(jié)構(gòu)，模擬人使用化妝品場景多次涂抹于模型表面，可以從黑色素細(xì)胞功能、黑色素的合成以及向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)運代謝等多個功效機制出發(fā)，通過實驗技術(shù)獲取基因水平、蛋白水平與組織水平等多維度功效數(shù)據(jù)，可以對待測樣品進(jìn)行綜合全面的美白功效評估，比生物化學(xué)法和細(xì)胞生物學(xué)法更系統(tǒng)、更真實反應(yīng)產(chǎn)品美白功效。
格寧生物（ScreeNingBio，SNB）實驗室于2022年建立了基于體外重建3D黑色素表皮模型Skinovo® -Mela美白功效評估檢測平臺，采用模擬人涂抹化妝品使用場景將一定量待測物多次均勻涂抹于3D模型表面，主要檢測指標(biāo)包括黑色素相關(guān)基因表達(dá)、表觀亮度（L值）、模型中黑色素含量，可視化指標(biāo)包括表觀色度、黑色素分布、模型中黑色素細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)和酪氨酸酶活性等如表1。
針對每一個檢測指標(biāo)進(jìn)行詳細(xì)介紹：
國際照明委員會CIE建立的L*a*b*色度系統(tǒng)，在人體膚色分類、美白化妝品功效評價中得到了普遍認(rèn)可和應(yīng)用。其中L*表征表觀亮度，其值越大，顏色越偏向白色，小則越偏向黑色。在美白功效評估數(shù)據(jù)中，表觀亮度L數(shù)據(jù)可以原始數(shù)據(jù)呈現(xiàn)也可以以ΔL數(shù)據(jù)呈現(xiàn)如圖2。
經(jīng)過待測物處理后黑色素表皮模型中黑色素含量的變化是衡量待測物美白功效的黃金標(biāo)準(zhǔn)。黑色素是化學(xué)結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜的一類大分子聚合物，一般采用強酸或強堿溶解進(jìn)行絕對定量或相對定量圖3,4，可以根據(jù)客戶需求選擇方法進(jìn)行實驗。
格寧生物實驗室重點開發(fā)了基于3D皮膚模型研究美白功效的可視化技術(shù)，表觀色度變化是其中一個可視化指標(biāo)，待測樣品處理后，把模型放在根據(jù)個體類型角（Individual Typological Angle，ITA°）繪制的色度卡如圖5，是通過專業(yè)相機拍照觀察不同處理組模型表面黑素沉積的變化，可以肉眼可見、直觀地呈現(xiàn)待測物的美白效果如圖6。
待測物經(jīng)過皮膚模型表面涂抹并滲透到皮膚模型基底層到達(dá)黑色素細(xì)胞發(fā)揮其美白功效，是如何發(fā)揮美白功效、持續(xù)涂抹處理后3D表皮模型中黑色素細(xì)胞是什么狀態(tài)、黑色素合成過程中關(guān)鍵限速酶酪氨酸酶活力怎么樣、黑色素分布情況以及如何可視化呈現(xiàn)等等，這些問題一直是美白產(chǎn)品研發(fā)過程要解決的問題。 
待測物處理后的黑色素表皮模型進(jìn)行DOPA 染色和甲醛后固定后，顯微鏡水平拍照可以直觀地呈現(xiàn)基底層的黑色素細(xì)胞狀態(tài)以及待測樣品處理后細(xì)胞差異如圖7,8,9�；贒OPA染色結(jié)果，可以看出黑色素細(xì)胞呈現(xiàn)了正常的胞體形態(tài)表明待測物沒有明顯的毒性，與基質(zhì)對照組相比，待測樣品組黑色素細(xì)胞數(shù)量明顯減少，黑色細(xì)胞形態(tài)多數(shù)呈梭形雙極狀，多極樹突狀細(xì)胞明顯變少變短，限制了向周圍角質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運黑色素的能力。黑色素細(xì)胞胞體顏色明顯比對照組白，證明酪氨酸酶合成黑色素的活力受到抑制。由此可見，利用3D皮膚模型基于黑色素細(xì)胞DOPA染色不僅可以直觀地評價待測物的美白功效，還能從美白機制維度給出證據(jù)。
黑色素2D可視化分布采用Fontana-Masson(FM) 嗜銀染色，利用黑色素具有將銀氨溶液還原為金屬銀的特性即嗜銀反應(yīng)來顯示黑色素，染色后黑色素呈黑色如圖10，是目前常用的黑色素特殊染色的方法之一，將染色后的玻片掃描并用ImageJ分析黑色素面積，分析比較對照組和待測樣品組差異，確定待測樣品的美白功效。
另外，我們可以借助不同的顯微鏡技術(shù)掃描3D黑色素表皮模型不同厚度的黑色素，可視化地呈現(xiàn)黑色素的分布和數(shù)量變化如圖11,12（可參考https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34822483/）。
重建3D黑色素表皮模型是一種持續(xù)生長的特殊生物檢測工具，模型的組織結(jié)構(gòu)、活細(xì)胞層數(shù)、角質(zhì)層厚度隨模型培養(yǎng)生長時間發(fā)生變化，對待測物的吸收滲透能力也隨之發(fā)生改變，所以待測物表面涂抹的時間窗口（Time Window）對檢測結(jié)果有很大影響。正常機體條件下黑色素表達(dá)水平不高，可以引入物理或化學(xué)誘導(dǎo)因素比如紫外線UV、α-MSH刺激等，從組成型表達(dá)的黑色素和誘導(dǎo)型表達(dá)的黑色素兩個維度研究，對檢測結(jié)果的信號窗口（Signal Window）也有很大影響。格寧生物可以根據(jù)客戶需求定制方法或者參考國內(nèi)團(tuán)標(biāo)的方法開展待測樣品的美白功效的研究和驗證。
總之，重建3D黑色素表皮模型是研究驗證待測樣品美白功效的有效工具之一，可實現(xiàn)化妝品原料及配方的體外科學(xué)檢測并與臨床評估結(jié)果保持一致性，不僅可以回答待測物是否有美白功效，還可以回答如何發(fā)揮美白功效等調(diào)節(jié)機制問題，并且具有檢測周期短，成本低、可重現(xiàn)性好等優(yōu)點。重建3D黑色素表皮模型在美白化妝品以及藥物制劑對調(diào)節(jié)皮膚色素沉著的功效研發(fā)中得到廣泛應(yīng)用。
重建3D黑色素表皮模型以人源正常組織角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素細(xì)胞為種子以一定的比例接種于特定生長環(huán)境中，經(jīng)過浸沒培養(yǎng)和氣液培養(yǎng)增殖分化出類似于正常人表皮復(fù)層組織結(jié)構(gòu)，模擬人使用化妝品場景多次涂抹于模型表面，可以從黑色素細(xì)胞功能、黑色素的合成以及向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)運代謝等多個功效機制出發(fā)，通過實驗技術(shù)獲取基因水平、蛋白水平與組織水平等多維度功效數(shù)據(jù)，可以對待測樣品進(jìn)行綜合全面的美白功效評估，比生物化學(xué)法和細(xì)胞生物學(xué)法更系統(tǒng)、更真實反應(yīng)產(chǎn)品美白功效。
格寧生物（ScreeNingBio，SNB）實驗室于2022年建立了基于體外重建3D黑色素表皮模型Skinovo® -Mela美白功效評估檢測平臺，采用模擬人涂抹化妝品使用場景將一定量待測物多次均勻涂抹于3D模型表面，主要檢測指標(biāo)包括黑色素相關(guān)基因表達(dá)、表觀亮度（L值）、模型中黑色素含量，可視化指標(biāo)包括表觀色度、黑色素分布、模型中黑色素細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)和酪氨酸酶活性等如表1。
針對每一個檢測指標(biāo)進(jìn)行詳細(xì)介紹：
國際照明委員會CIE建立的L*a*b*色度系統(tǒng)，在人體膚色分類、美白化妝品功效評價中得到了普遍認(rèn)可和應(yīng)用。其中L*表征表觀亮度，其值越大，顏色越偏向白色，小則越偏向黑色。在美白功效評估數(shù)據(jù)中，表觀亮度L數(shù)據(jù)可以原始數(shù)據(jù)呈現(xiàn)也可以以ΔL數(shù)據(jù)呈現(xiàn)如圖2。
經(jīng)過待測物處理后黑色素表皮模型中黑色素含量的變化是衡量待測物美白功效的黃金標(biāo)準(zhǔn)。黑色素是化學(xué)結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜的一類大分子聚合物，一般采用強酸或強堿溶解進(jìn)行絕對定量或相對定量圖3,4，可以根據(jù)客戶需求選擇方法進(jìn)行實驗。
格寧生物實驗室重點開發(fā)了基于3D皮膚模型研究美白功效的可視化技術(shù)，表觀色度變化是其中一個可視化指標(biāo)，待測樣品處理后，把模型放在根據(jù)個體類型角（Individual Typological Angle，ITA°）繪制的色度卡如圖5，是通過專業(yè)相機拍照觀察不同處理組模型表面黑素沉積的變化，可以肉眼可見、直觀地呈現(xiàn)待測物的美白效果如圖6。
待測物經(jīng)過皮膚模型表面涂抹并滲透到皮膚模型基底層到達(dá)黑色素細(xì)胞發(fā)揮其美白功效，是如何發(fā)揮美白功效、持續(xù)涂抹處理后3D表皮模型中黑色素細(xì)胞是什么狀態(tài)、黑色素合成過程中關(guān)鍵限速酶酪氨酸酶活力怎么樣、黑色素分布情況以及如何可視化呈現(xiàn)等等，這些問題一直是美白產(chǎn)品研發(fā)過程要解決的問題。
待測物處理后的黑色素表皮模型進(jìn)行DOPA 染色和甲醛后固定后，顯微鏡水平拍照可以直觀地呈現(xiàn)基底層的黑色素細(xì)胞狀態(tài)以及待測樣品處理后細(xì)胞差異如圖7,8,9�；贒OPA染色結(jié)果，可以看出黑色素細(xì)胞呈現(xiàn)了正常的胞體形態(tài)表明待測物沒有明顯的毒性，與基質(zhì)對照組相比，待測樣品組黑色素細(xì)胞數(shù)量明顯減少，黑色細(xì)胞形態(tài)多數(shù)呈梭形雙極狀，多極樹突狀細(xì)胞明顯變少變短，限制了向周圍角質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)運黑色素的能力。黑色素細(xì)胞胞體顏色明顯比對照組白，證明酪氨酸酶合成黑色素的活力受到抑制。由此可見，利用3D皮膚模型基于黑色素細(xì)胞DOPA染色不僅可以直觀地評價待測物的美白功效，還能從美白機制維度給出證據(jù)。
黑色素2D可視化分布采用Fontana-Masson(FM) 嗜銀染色，利用黑色素具有將銀氨溶液還原為金屬銀的特性即嗜銀反應(yīng)來顯示黑色素，染色后黑色素呈黑色如圖10，是目前常用的黑色素特殊染色的方法之一，將染色后的玻片掃描并用ImageJ分析黑色素面積，分析比較對照組和待測樣品組差異，確定待測樣品的美白功效。
另外，我們可以借助不同的顯微鏡技術(shù)掃描3D黑色素表皮模型不同厚度的黑色素，可視化地呈現(xiàn)黑色素的分布和數(shù)量變化如圖11,12（可參考https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34822483/）。
重建3D黑色素表皮模型是一種持續(xù)生長的特殊生物檢測工具，模型的組織結(jié)構(gòu)、活細(xì)胞層數(shù)、角質(zhì)層厚度隨模型培養(yǎng)生長時間發(fā)生變化，對待測物的吸收滲透能力也隨之發(fā)生改變，所以待測物表面涂抹的時間窗口（Time Window）對檢測結(jié)果有很大影響。正常機體條件下黑色素表達(dá)水平不高，可以引入物理或化學(xué)誘導(dǎo)因素比如紫外線UV、α-MSH刺激等，從組成型表達(dá)的黑色素和誘導(dǎo)型表達(dá)的黑色素兩個維度研究，對檢測結(jié)果的信號窗口（Signal Window）也有很大影響。格寧生物可以根據(jù)客戶需求定制方法或者參考國內(nèi)團(tuán)標(biāo)的方法開展待測樣品的美白功效的研究和驗證。
總之，重建3D黑色素表皮模型是研究驗證待測樣品美白功效的有效工具之一，可實現(xiàn)化妝品原料及配方的體外科學(xué)檢測并與臨床評估結(jié)果保持一致性，不僅可以回答待測物是否有美白功效，還可以回答如何發(fā)揮美白功效等調(diào)節(jié)機制問題，并且具有檢測周期短，成本低、可重現(xiàn)性好等優(yōu)點。重建3D黑色素表皮模型在美白化妝品以及藥物制劑對調(diào)節(jié)皮膚色素沉著的功效研發(fā)中得到廣泛應(yīng)用。
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