膠原蛋白純化策略與案例分享

膠原蛋白作為一種功能與結(jié)構(gòu)兼具的蛋白質(zhì)，在醫(yī)藥、化妝品及生物材料領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。隨著膠原蛋白需求的快速增長，重組膠原蛋白的技術(shù)日趨成熟，逐漸成為主流的生產(chǎn)方式。本文將根據(jù)天然與重組膠原蛋白的特點，分別介紹其純化工藝并分享相關(guān)案例。

膠原蛋白是一種在皮膚、骨骼及肌腱中廣泛存在的結(jié)構(gòu)蛋白，其基本單位由三條多肽鏈組成，形成穩(wěn)定的三股螺旋結(jié)構(gòu)。這種獨特的結(jié)構(gòu)使得膠原蛋白在組織修復(fù)、組織工程及美容保健等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。

天然膠原蛋白主要通過物理、化學(xué)或酶解等方法從動物組織（如皮膚、骨骼）中提取。常見的純化方式包括：

• 酸堿水解法：將動物組織（如皮膚、骨骼等）清潔和切片、粉碎后，通過酸解/堿解作用將膠原蛋白從中溶解，再進(jìn)行中和、過濾、濃縮換液等步驟得到膠原蛋白。

• 酶解法：將動物組織（如皮膚、骨骼等）清潔和切片、粉碎后，用特定蛋白酶進(jìn)行酶解，再通過離心、過濾、濃縮換液等步驟分離出膠原蛋白。

然而，隨著質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高，通過傳統(tǒng)方法天然提取的膠原蛋白面臨著雜質(zhì)（如內(nèi)毒素）的控制難題，這為后續(xù)的純化工藝提出了更高的要求。博格隆的陰離子交換層析介質(zhì)可用于純化，以生產(chǎn)更高純度的膠原蛋白。

重組膠原蛋白是通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)的膠原蛋白，避免了動物源膠原蛋白的質(zhì)量波動和安全隱患。

重組膠原蛋白的生產(chǎn)體系主要包括大腸桿菌、酵母等表達(dá)系統(tǒng)，具有產(chǎn)率高、成本低、周期短等優(yōu)勢。其工藝路線包括發(fā)酵表達(dá)、鹽析、固液分離、澄清、親和層析、離子交換和多模式層析等純化步驟。

Fig.1 分離純化流程

膠原蛋白的純化工藝應(yīng)根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)和應(yīng)用需求選擇。若在構(gòu)建時設(shè)計了標(biāo)簽，可采用親和層析進(jìn)行高效純化；若無標(biāo)簽，則可根據(jù)膠原蛋白與雜蛋白的電荷、疏水性及分子大小等差異，選擇離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析等方式，或通過復(fù)合模式層析進(jìn)一步提高純度。這些方法可靈活調(diào)整，以滿足不同的應(yīng)用和純度需求。

親和層析是一種基于特異性結(jié)合的分離方法，常用于重組膠原蛋白的初步純化。通過在表達(dá)的膠原蛋白中插入標(biāo)簽，如His標(biāo)簽，對目標(biāo)蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合捕獲。

Ni²⁺對His標(biāo)簽具有特異性親和，可以使用博格隆Ni Bestarose FF或Ni Bestarose HP等已鰲合金屬離子的親和填料進(jìn)行捕獲，通常一步可達(dá)到80%以上的純度，雜質(zhì)去除效果顯著。隨后，再使用分子篩進(jìn)行精純以及濃縮換液，得到膠原蛋白原液。

Fig.2 親和層析工藝路線

Ni Bestarose FF在組氨酸標(biāo)簽重組蛋白純化中的應(yīng)用

• 層析柱：EzFast 1mL

• 柱床高度：2.5cm

• 緩沖液A：20mM PB、0.5 M NaCl、20mM 咪唑、pH7.6

• 緩沖液B：20mM PB、0.5M NaCl、500mM 咪唑、pH7.6

• 樣品：大腸桿菌表達(dá)帶有組氨酸標(biāo)簽重組蛋白裂解液上清

• 流速：0.3mL/min

Fig.3 Ni Bestarose FF純化組氨酸標(biāo)簽重組蛋白

離子交換層析基于目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜質(zhì)的帶電荷種類和數(shù)量差異進(jìn)行分離。膠原蛋白對pH敏感，適合偏酸性的緩沖體系，陽離子交換層析適用于大腸桿菌胞內(nèi)可溶表達(dá)的重組膠原蛋白快速捕獲。陰離子交換層析則是精純階段去除內(nèi)毒素的主要手段。

Fig.4 離子交換層析工藝路線

Fig.5 Diamond CD-S純化膠原蛋白

本案例中Diamond CD-S介質(zhì)在線性梯度條件下展示了極高的分辨率，成功將重組膠原蛋白與雜質(zhì)分離。

對于一些特殊的純化需求，在離子交換層析中未能達(dá)到工藝要求的情況下，可選用多模式層析填料。復(fù)合模式層析能夠同時利用電荷、疏水性等多種相互作用，提高純化選擇性。對比單一模式下的純化方法，多模式層析可以通過改變pH、電導(dǎo)或者pH-鹽雙重梯度的策略進(jìn)行洗脫，對樣品有著更好的選擇性。

Fig.6 復(fù)合模式層析工藝路線

Fig.7 Diamond MMC Mustang純化膠原蛋白

膠原蛋白分子量較大，可以利用凝膠過濾填料進(jìn)行緩沖液的置換，尤其在親和標(biāo)簽切除后，去除親和標(biāo)簽。

膠原蛋白的純化技術(shù)不斷發(fā)展，為組織工程、生物醫(yī)藥和美容保健等領(lǐng)域提供高質(zhì)量的產(chǎn)品。無論是天然提取還是重組表達(dá)，合理的純化策略和高效的層析介質(zhì)是確保膠原蛋白產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。博格隆層析介質(zhì)以其優(yōu)異的分離純化效果和良好的批間一致性，廣泛應(yīng)用于膠原蛋白從實驗室到工業(yè)化生產(chǎn)的分離純化工藝中。